Transactivación de IRE1 y PERK por una molécula pequeña inhibidora de quinasa

Abstract

Las células eucariontes tienen la capacidad de responder a la acumulación de proteínas mal plegadas en el retículo endoplásmico a través de un mecanismo conocido como respuesta a proteínas mal plegadas (UPR). Dos de los tres sensores del UPR; IREl y PERK participan activamente en las decisiones de sobrevida y muerte celular, por lo que constituyen potenciales candidatos para blancos terapéuticos. Ambos sensores son proteínas quinasa y sus regiones luminales son altamente similares e intercambiables, lo que sugiere un mecanismo de activación común. IRE 1 además contiene un dominio endoribonucleasa yuxtapuesto al dominio quinasa. El uso del inhibidor de quinasa APY29, reveló que la ocupación de sitio ATP del dominio quinasa de IREl provoca un cambio conformacional que induce su transactivación y oligomerización, permitiendo así la activación de los dominios endon·ibonucleasa adyacentes. Recientemente se encontró que inhibidores de quinasa pueden actuar como agonistas de la actividad quinasa, al promover la transactivación y oligomerización. Dada la similitud en los mecanismos de activación entre IREl y PERK en esta tesis proponemos estudiar el efecto de análogos de APY29 sobre la actividad quinasa de PERK. Nuestros resultados indican que el análogo AM9 es más potente y selectivo que APY29 en la inducción de la actividad endoribonucleasa de IREl, tanto in vitro como en líneas celulares, y funciona promoviendo su transactivación y oligomerización. Este análogo además es capaz de unirse e inhibir la actividad quinasa de PERK in vitro. Sin embargo y de manera interesante, análisis en líneas celulares muestran que AM9 puede actuar, dependiendo de la concentración, como agonista y como un inhibidor de la actividad quinasa de PERK, mostrando una curva de activación tipo campana. Esto sugiere que PERK se activa por un mecanismo dependiente de transactivación y oligomerización. Nuestros resultados muestran que un mismo inhibidor de quinasa puede modular a dos de los tres sensores del UPR. Por otra parte, estos resultados demuestran que PERK es activable por inhibidores de quinasa, lo cual es importante de considerar durante el uso y diseño de drogas que apunten a este sensor del UPR.

Eukaryotic cells have the capacity to respond to the accumulation of unfolded proteins in the endoplasmic reticulum via a mechanism known as the unfolded protein response (UPR). Two of the three sensors of the UPR, IRE 1 and PERK, are actively involved in decisions of survival and cell death, which makes them important candidates as therapeutic targets. Both sensors are kinases, IRE 1 also have an endoribonuclease domain, with highly similar and interchangeable luminal segment, suggesting a common activation mechanism. Using the small molecule kinase inhibitor APY29, it was revealed that the occupancy of the IREl kinase catalytic domain causes a conformational change that induces transactivation and oligomerization of the protein thereby activating its appended endoribonuclease domains. Moreover, it has been reported that in sorne cases kinase inhibitors may act as agonists of the kinase activity by promoting transactivation and oligomerization. Since IRE 1 and PERK are very similar in activation in this thesis we propose to study the effect of APY29 analogs on kinase activity of PERK. Our results indicate that in both, in vitro and in cell lines, the analog AM9 is a more potent and selective activator of IREl endoribonuclease activity than APY29, promoting its transactivation and oligomerization. Furthermore, AM9 is capable of binds and inhibits kinase activity of PERK in vitro. Nevertheless, analysis in cell lines shows that AM9 acts as both, agonist and antagonist of the PERK kinase activity, depending in the concentration, displaying a bell-shaped activation curve. This suggests that like IRE 1, PERK is activated by a mechanism involving transactivation and oligomerization. In summary, we show that the same kinase inhibitor can modulate two of the three UPR sensors. These results also suggest that PERK can be activated by a kinase inhibitor, this will be important to consider in the design of drugs that target PERK.