info:eu-repo/semantics/masterThesis
Analisis toxicovenómico y producción de sueros experimentales del veneno de micrurus dumerilii (Serpentes: Elapidae)
Toxicovenomic analysis and experimental sera production of micrurus dumerilii (Serpentes: Elapidae)
Autor
Gómez Robles, Jeisson
Institución
Resumen
RESUMEN: Micrurus dumerilii pertenece a la familia Elapidae. Seis subespecies son reconocidas y cinco de estas se distribuyen en Colombia, donde representa una de las especies de importancia médica. Su veneno ha sido caracterizado en cuanto a su composición proteica, siendo las proteínas de tipo fosfolipasas A2 (PLA2) las más abundantes. Sin embargo, se desconoce cuáles de estos componentes son los responsables de su toxicidad y si esta composición varía con relación a la distribución de esta especie en Colombia. Se llevó a cabo un análisis toxicovenómico del veneno de M. dumerilii, usando Cromatografía en fase reversa (RP-HPLC) y evaluando cada fracción en su efecto letal en un modelo murino. Las fracciones letales fueron caracterizadas mediante pruebas in-vivo (Edematizante y Miotóxica) e in-vitro (Fosfolipasas A2), electroforesis y masas MALDI-TOF/TOF. Además, se emplearon como inmunógeno para producir sueros experimentales en conejos, y evaluar reactividad frente al veneno por ELISA y capacidad neutralizante frente el veneno completo de esta especie. El perfil cromatográfico de M. dumerilii de Antioquia mostró 32 picos, de los cuales 14 resultaron ser los más abundantes, y de estos, solo uno (fracción 9 “F9”) demostró letalidad a diferentes concentraciones en modelo murino. F9 fue enzimáticamente activa sobre el sustrato 4-NOBA. Además, indujo edema y miotoxicidad. Los perfiles cromatográficos del veneno de M. dumerilii Chocó y Santander mostraron algunas diferencias relacionadas a la presencia o ausencia de algunos picos, así como en la intensidad de algunos otros. Diferencias similares fueron observadas también entre los perfiles electroforéticos. Sin embargo, en todos los casos solo la fracción F9 mostró letalidad. El perfil electroforético de los tres picos mostró la presencia, en cada uno de estos, de dos bandas electroforéticas, una de 9 kDa y otra de 15 kDa. Análisis por MALDI-TOF/TOF mostraron masas de 13217.77Da, 7144.06Da y 7665.55Da. Además, F9 fue reconocida por anticuerpos específicos contra otras PLA2s. La inmunización con F9 indujo una respuesta inmune con títulos de anticuerpos hasta 1:10000. Después de fraccionar el suero con Ácido caprílico, se obtuvieron IgGs con capacidad neutralizante de la letalidad contra F9 y el veneno completo
de M. dumerilii (2DL50) en dosis de 2mg/ratón. En conclusión, estos resultados mostraron que, aunque hay cierta diferencia entre los venenos de acuerdo con su origen, en todos los casos, solo una fracción es responsable de la toxicidad neurotóxica de M. dumerilii. Además, los anticuerpos producidos contra esta fracción neutralizaron el veneno completo. Lo anterior posibilitaría la producción de esta toxina de forma recombinante y emplearse como inmunógeno en la producción de antivenenos anticoral y en consecuencia suplir la escasez de este veneno para los procesos de producción. ABSTRACT: Micrurus dumerilii belongs to the Elapidae family. Six subspecies are recognized and five of these are distributed in Colombia, where it represents one of the species of medical importance. Its venom has been characterized in terms of its protein composition, with phospholipase A2 (PLA2s) type proteins being the most abundant. However, it is unknown which of these components are responsible for its toxicity and if this composition varies in relation to the distribution of this species in Colombia. A toxicovenomic analysis of M. dumerilii venom was carried out using Reversed Phase Chromatography (RP-HPLC) and each fraction was evaluated for its lethal effect in a murine model. The lethal fractions were characterized by in-vivo (Edematizing and Myotoxic) and in-vitro (Phospholipase A2) tests, electrophoresis and MALDI-TOF/TOF masses. In addition, they were used as an immunogen to produce experimental sera in rabbits, and to evaluate reactivity against the venom by ELISA and neutralizing capacity against the complete venom of this species. The chromatographic profile of M. dumerilii from Antioquia showed 32 peaks, of which 14 turned out to be the most abundant, and of these, only one (fraction 9 “F9”) showed lethality at different concentrations in a murine model. F9 was enzymatically active on the 4-NOBA substrate. In addition, it induced edema and myotoxicity. The chromatographic profiles of the venom of M. dumerilii Chocó and Santander showed some differences related to the presence or absence of some peaks, as well as the intensity of some others. Similar differences were also observed between the electrophoretic profiles. However, in all cases only the F9 fraction showed lethality. The electrophoretic profile of the three peaks showed the presence, in each of them, of two electrophoretic bands, one at 9 kDa and the other at 15 kDa. MALDI-TOF/TOF analysis showed masses of 13217.77Da, 7144.06Da and 7665.55Da. Furthermore, F9 was recognized by specific antibodies against other PLA2s. Immunization with F9 induced an immune response with antibody titers up to 1:10,000. After fractionating the serum with caprylic acid, IgGs with lethality neutralizing capacity against F9 and the complete venom of M. dumerilii (2DL50) were obtained at doses of 2mg/mouse.
In conclusion, these results showed that, although there is some difference between the venoms according to their origin, in all cases, only a fraction is responsible for the neurotoxic toxicity of M. dumerilii. Furthermore, the antibodies produced against this fraction neutralized the entire venom. The foregoing would make it possible to produce this toxin recombinantly and to use it as an immunogen in the production of anticoral antivenoms and, consequently, fill the shortage of this poison for production processes.