Análise molecular do vírus da hepatite Delta: desenvolvimento de transcrição reversaPCR em tempo real e nested PCR-RFLP para quantificação e genotipagem viral
Registro en:
SOUZA, Luan Felipo Botelho. Análise molecular do vírus da hepatite Delta: desenvolvimento de transcrição reversa-PCR em tempo real e nested PCR-RFLP para quantificação e genotipagem viral. 2014. 80 f. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental, Fundação Universidade Federal de Rondônia, Porto Velho, 2014.
Autor
Souza, Luan Felipo Botelho
Vieira, Deusilene Souza
Salcedo, Juan Miguel Villalobos
Institución
Resumen
Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação
em Biologia Experimental – PGBIOEXP – do
Núcleo de Saúde da Universidade Federal de Rondônia
para obtenção do título de mestre. O vírus da hepatite Delta (HDV) é um patógeno que causa um infecção grave e
rapidamente progressiva nos pacientes portadores. A determinação da quantidade e do genótipo do
vírus circulante no sangue de pacientes com a infecção pelo HDV é importante para o diagnóstico,
monitoramento do tratamento e para oferecer suporte para estudos de acompanhamento da
replicação viral no curso da doença. Neste estudo desenvolvemos in house um ensaio capaz de
detectar e quantificar o vírus da hepatite Delta através de amostras de soro baseando-se em uma
Transcrição reversa–PCR em tempo real quantitativa (HDV RT-qPCR) e uma nested PCR-RFLP
para a genotipagem do HDV. Para a determinação da carga viral foram produzidos dois calibradores
padrão, um cDNA HDV clonado em plasmídeo e um transcrito de RNA HDV. Para a validação este
ensaio foram utilizadas 140 amostras clínicas de soro, sendo 100 amostras clínicas de pacientes
anti-HDV e antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg) reagentes por ELISA, 30
amostras clínicas de doadores de sangue, 5 amostras clínicas monoinfectadas pelo vírus da
hepatite B (HBV) e 5 amostras monoinfectadas pelo vírus da hepatite C (HCV). Para genotipagem
foi estabelecida uma nested PCR-RFLP, utilizando Xho l e a Sma l para digerir os amplicons, os
resultados corroboraram com as análises por sequenciamento. O desempenho do ensaio HDV RTqPCR
foi melhor quando utilizado o calibrador padrão HDV baseado em cDNA clonado em
plasmídeo linear com uma eficiência de 99,8% e linearidade de R2 0,97 e uma especificidade de
100% nos ensaios in vitro. Este estudo representa o primeiro ensaio HDV RT-qPCR desenvolvido
com amostras clínicas do Brasil e oferece um grande potencial para novos estudos de eficácia
clínica da terapêutica antiviral para utilização em pacientes com hepatite Delta na região ocidental
da Amazônia.