Tese
Associação entre o extrato aquoso e o óleo essencial do Cymbopogon citratus e o 5-fluorouracil na resposta antitumoral em camundongos com sarcoma 180
Association between aqueous extract and essential oil of Cymbopogon citratus and 5- fluorouracil in the antitumor response in mice with sarcoma 180
Registro en:
SANTANA, Ingrede Tatiane Serafim. Associação entre o extrato aquoso e o óleo essencial do Cymbopogon citratus e o 5-fluorouracil na resposta antitumoral em camundongos com sarcoma 180. 2022. 129 f. Tese (Doutorado em Ciências Fisiológicas) - Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, 2022.
Autor
Santana, Ingrede Tatiane Serafim
Institución
Resumen
In oncology, chemotherapy remains the most prevalent therapy, using antineoplastic drugs such
as 5-fluorouracil (5-FU). However, due to limitations, such as cellular non-specificity and
associated adverse effects, the use of alternative therapies, such as medicinal plants, has
gradually been observed among cancer patients, mainly with the aim of mitigating associated
adverse effects, such as nausea and vomiting. The Cymbopogon citratus, popularly known as
lemongrass, is among the medicinal plants used by cancer patients; however, despite the
identification of beneficial properties in its use, the association of its preparations (such as
extracts and essential oils) with antineoplastics is little explored. In this sense, the present study
aimed to investigate the association between the aqueous extract and the essential oil of
Cymbopogon citratus and 5-fluorouracil in the antitumor response in mice with Sarcoma 180.
This is an experimental study approved by the Animal Research Ethics Committee (CEPA),
opinions nº 17/2019 and nº 2726280621. Chromatographic analysis was performed to identify
constituents of the extract and essential oil of Cymbopogon citratus. In vitro assays were
performed to evaluate cytotoxicity in lung cancer (A549), melanoma (B16-F10) and glioma
(C6) tumour cell lines, using the Sulforhodamine B method, and to evaluate the presence of
hemolytic activity in erythrocytes, through of hemolysis assay. The evaluation of the
association of the aqueous extract of Cymbopogon citratus (EACC) and Cymbopogon essential
oil citratus (OECC) with 5-FU was performed in an in vivo assay using the experimental tumour
Sarcoma 180 in a 9-day protocol (1st day - inoculation of the S180 tumour in the left axillary
region; 2nd to 8th day - oral treatments (EACC, OECC and vehicle) or intraperitoneal (5 - FU),
and 9th day - a collection of blood material, organs (liver, kidneys and spleen) and tumors);
additional analyzes were also carried out with citral, the constituent identified as the majority
of the OECC; the doses used corresponded to 50 and 100 mg/kg/day for EACC, 25 and 50
mg/kg/day for OECC and citral and 25 mg/kg/day for 5-FU. The parameters evaluated in
relation to the association of EACC, OECC or the isolated citral constituent with 5-FU included
tumour inhibition and toxicological aspects related to body mass, water intake and feed
consumption, organ mass, renal biochemical parameters (urea, creatinine and uric acid) and
liver (alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase and alkaline phosphatase),
erythrocyte hematological parameters (red blood cells, hemoglobin and hematocrit) and
leukocytes (total and differential leukocytes) and morphological analysis of the organs.
Statistical analyzes included non-linear regression, the Shapiro Wilk normality test, one-way
and two-way analysis of variance and Tukey's post-test, using the Prisma program version 8.0.2
(GraphPad Software). The chromatographic analysis identified that chlorogenic acid is present
in the EACC and that citral represents the major constituent of the OECC. In vitro assays
showed that EACC showed weak cytotoxic activity for A549, B16 - F10 and C6 tumour lines,
with a degree of cellular inhibition (GI%) < 50%; in turn, OECC and citral showed high
cytotoxic activity for the evaluated strains, with %GI > 75%; additionally, the OECC showed
an inhibitory concentration capable of causing 50% of the maximum effect (CI50) < 30 μg / mL
for A549 and B16-F10 strains, considered promising for oncology. Hemolysis assay identified
that EACC showed low toxicity to erythrocytes at a concentration of 1000 μg / mL; in turn,
OECC and citral showed toxicity at concentrations of 500 and 1000 μg / mL and low toxicity
at concentrations of 250 μg / mL. An in vivo assay to investigate the association of EACC,
OECC and citral with 5-FU, identified that there was no significant influence of the association
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in relation to the inhibition of tumour growth of S180. In the experiment with EACC, the
treatment of S180 with 5-FU showed tumor growth of 0,36 ± 0,07 g and the treatments with
EACC 50 and 100 mg/kg/day + 5 – FU of 0,67 ± 0,08 g (p=0,3532) and 0,57 ± 0,06 (p=0,7539),
respectively. In the experiment with OECC and with the isolated citral constituent, group 5 -
FU showed tumor growth of 0,22 ± 0,04 g, the groups treated with 25 and 50 mg/kg/day of
OECC + 5-FU of 0,55 ± 0,13 g (p=0,3235) and 0,24 ± 0,07 g (p>0,9999) and for citral 25 and
50 mg/kg/day + 5-FU of 0,28 ± 0, 04 g (p=0,9971) and 0,22 ± 0,06 g (p>0, 9999), respectively.
Toxicological analyzes identified that the association of EACC with 5-FU resulted in changes
in renal biochemical parameters; elevation of uric acid was identified against the association of
EACC 100 mg/kg/day with 5-FU and a reduction in creatinine was identified against the
association between EACC 50 and 100 mg/kg/day with 5-FU, suggesting that despite the
presence of uric acid elevation, a nephroprotective role may be present in reducing creatinine
values in relation to the 5-FU treated group alone. In the use of OECC 50 mg/kg/day with 5-
FU, an increase in water intake was found when compared to the isolated treatment of 5-FU,
with no statistical difference with the negative control with tumour, suggesting the preservation
of drinking habits of water altered by 5-FU; no toxicological alterations related to the
association of the isolated citral constituent with 5 - FU were identified. Thus, the findings point
out that the OECC has a promising role against the B16 - F10 and A549 strains, which may be
mainly related to citral, identified as the major constituent of the OECC and which has high
cytotoxic activity against the tumour strains evaluated; however, the presence of hemolytic
activity in the OECC at concentrations => 250 μg / mL may represent a limitation in its use and
should be considered in further analyses. Additionally, the association of EACC, OECC and
citral with the antineoplastic 5-FU concluded that there was no influence of the association
against tumour inhibition of S180, at the doses used in the present study, and that changes may
occur in water intake against the treatment OECC associated with 5 - FU and in renal parameters
compared to the associated treatment of EACC with 5 - FU, in oncological therapy. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Fundação de Apoio a Pesquisa e à Inovação Tecnológica do Estado de Sergipe - FAPITEC/SE utilizando o método Suforodamina B, e para avaliação da presença de atividade hemolítica em
eritrócitos, através de ensaio de hemólise. A avaliação da associação do extrato aquoso do
Cymbopogom citratus (EACC) e do óleo essencial do Cymbopogon citratus (OECC) com o 5
– FU foi realizada em ensaio in vivo utilizando o tumor experimental Sarcoma 180 em protocolo
de 9 dias (1º dia - inoculação do tumor S180 na região axilar esquerda; 2º ao 8º dia - tratamentos
por via oral (EACC, OECC e veículo) ou intraperitoneal (5-FU), e 9º dia - coleta de material
sanguíneo, órgãos (fígado, rins e baço) e tumores); análises adicionais também foram realizadas
com o citral, constituinte identificado como majoritário do OECC; as doses utilizadas
corresponderam a 50 e 100 mg/kg/dia para o EACC, 25 e 50 mg/kg/dia para o OECC e para o
citral e 25 mg/kg/dia para o 5-FU. Os parâmetros avaliados frente a associação do EACC,
OECC ou do constituinte isolado citral com o 5-FU incluíram a inibição tumoral e aspectos
toxicológicos relacionados a massa corpórea, ingesta de água e consumo de ração, massa dos
órgãos, parâmetros bioquímicos renais (ureia, creatinina e ácido úrico) e hepáticos (alanina
aminotransferase, aspartato aminotransferase e fosfatase alcalina), parâmetros hematológicos
eritrocitários (hemácia, hemoglobina e hematócrito) e leucocitários (leucócito total e
diferencial) e análise morfológica dos órgãos. Análises estatísticas incluíram a regressão nãolinear, o teste de normalidade de Shapiro wilk, a análise de variância de uma e duas vias e o pós
teste de Tukey, utilizando o programa Prisma versão 8.0.2 (GraphPad Software). Análise
cromatográfica identificou que o ácido clorogênico está presente no EACC e que o citral
representa o constituinte majoritário do OECC. Ensaios in vitro evidenciaram que o EACC
apresentou atividade citotóxica fraca para as linhagens tumorais da A549, B16 - F10 e C6, com
grau de inibição celular (GI%) < 50%; por sua vez, o OECC e o citral apresentaram atividade
citotóxica alta para as linhagens avaliadas, com %GI > 75%; adicionalmente, o OECC
apresentou concentração inibitória capaz de provocar 50% do efeito máximo (CI50)< 30 μg/mL
para as linhagens da A549 e B16-F10, considerado promissor para oncologia. Ensaio de
hemólise identificou que o EACC apresentou toxicidade leve a eritrócitos na concentração de
1000 μg/mL; por sua vez, o OECC e o citral apresentaram toxicidade nas concentrações de 500
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e 1000 μg/mL e toxicidade leve na concentração de 250 μg/mL. Ensaio in vivo, para
investigação da associação do EACC, OECC e do citral com o 5-FU, identificou que não houve
influência significativa da associação em relação a inibição do crescimento tumoral do S180.
No experimento com EACC, o tratamento do S180 com 5-FU apresentou crescimento tumoral
de 0,36 ± 0,07 g e os tratamentos com EACC 50 e 100 mg/kg/dia + 5-FU de 0,67 ± 0,08 g
(p=0,3532) e 0,57 ± 0,06 (p=0,7539), respectivamente. No experimento com OECC e com o
constituinte isolado citral, o grupo 5-FU apresentou crescimento tumoral de 0,22 ± 0,04 g, os
grupos tratados com 25 e 50 mg/kg/dia do OECC + 5-FU de 0,55 ± 0,13 g (p=0,3235) e 0,24 ±
0,07 g (p>0,9999) e para o citral 25 e 50 mg/kg/dia + 5-FU de 0,28 ± 0,04 g (p=0,9971) e 0,22
± 0,06 g (p>0,9999), respectivamente. Análises toxicológicas identificaram que a associação
do EACC com o 5-FU resultou em alterações de parâmetros bioquímicos renais; elevação de
ácido úrico foi identificada frente a associação de EACC 100 mg/kg/dia com o 5-FU e redução
da creatinina foi identificada frente a associação entre o EACC 50 e 100 mg/kg/dia com o 5-
FU, sugerindo que apesar da presença de elevação de ácido úrico, papel nefroprotetor pode estar
presente ao reduzir valores de creatinina em relação ao grupo tratado isolado do 5-FU. No uso
do OECC 50 mg/kg/dia com o 5-FU, elevação da ingesta de água foi encontrada quando
comparado ao tratamento isolado do 5-FU, sem diferença estatística com o controle negativo
com tumor, sugerindo a preservação dos hábitos de ingesta de água alterados pelo 5-FU; não
foram identificadas alterações toxicológicas relacionadas a associação do constituinte isolado
citral com o 5-FU. Desse modo, os achados encontrados salientam que o OECC apresenta papel
promissor frente as linhagens B16-F10 e A549, que pode estar relacionado, principalmente, ao
citral, identificado como constituinte majoritário do OECC e que apresenta atividade citotóxica
alta frente as linhagens tumorais avaliadas; no entanto, a presença de atividade hemolítica no
OECC em concentrações => 250 μg/mL pode representar uma limitação em seu uso e deve ser
considerada em análises posteriores. Adicionalmente, a associação do EACC, OECC e do citral
com o antineoplásico 5-FU concluiu que não houve influência da associação frente a inibição
tumoral do S180, nas doses utilizadas no presente estudo, e que alterações podem ocorrer na
ingesta de água frente o tratamento associado do OECC com o 5-FU e em parâmetros renais
frente o tratamento associado do EACC com o 5-FU, na terapêutica oncológica. São Cristóvão