Dissertação
Imobilização e detecção de biomoléculas em matrizes de poli (ácido 4-hidroxifenilacético) : aplicações no desenvolvimento de genossensores
Registro en:
SILVA, Tatiana Aparecida Rosa da. Imobilização e detecção de biomoléculas em matrizes de poli (ácido 4-hidroxifenilacético) : aplicações no desenvolvimento de genossensores. 2008. 108 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Exatas e da Terra) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2008.
Autor
Silva, Tatiana Aparecida Rosa da
Institución
Resumen
Modified electrodes with polymer films are efficient matrix to biomolecules
immobilization. Therefore due the anionic or cationic surface functionalization, they
promote the electrostatic repulsion of interferents and efficient interaction with
immobilized biomolecules. Of this form, they stimulate great advance in the
development of biossensors and sensors.
Aiming at the incorporation of nucleotides, oligonucleotides and DNA
fragments were made studies of the electropolymerization of the 4-hydroxyphenylacetic
acid monomer on graphite surface, to obtain the best condition of polymerization and
characterization of the surface. In more acid pH values, was observed the films
formation with bigger electroactive character and with higher electrons transference in
redox K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6. The characterization of these films by means of AFM and
SEM confirmed the deposition of the polymer onto surface.
Electrooxidation and optimization studies of the adenosine monophosphate and
guanosine monophosphate immobilizated onto poly(4-HPA) films were carried out at
different pH values. Variation of the experimental conditions, particularly of the pH of
the electrolytic solution, showed that the oxidation potentials of immobilized AMP or
GMP onto the modified electrodes decreased with increasing of pH values of the
solution. Higher oxidation current was obtained to AMP in phosphate buffer (pH 7.50)
and GMP in acetate buffer (pH 4.50).
The immobilization and detection of oligonucleotide of 16-pb were carried out
on the poly(4-HPA). In the detection process with the complementary target was
observed decrease in the values of current, when compared with the response obtained
before of the hybridization.
The magnitude of the current signal of the eletrooxidation of nucleotides or
oligonucleotides was bigger for the modified graphite electrodes with poly(4-HPA), in
relation to the graphite electrodes without modification. The amplitude of the current
signal is an important parameter that guarantees the sensitivity of the biosensors.
The immobilization and detection of DNA fragments of the dengue virus (DEN-
1) was carried out using ethidium bromide as hybridization indicator. The dsDNA
formation was monitored by means of the increase in the current signal, caused by
accumulation of the intercalator on the surface of the electrode.
Images of the surface topography for AFM indicate that the DEN-1 (ssDNA)
immobilization on the polymeric matrix results in reduction of the roughness and, after
the hybridization with the complementary target (dsDNA), was observed formation of
higher globules number. The AFM images showed the immobilization of biomolecules
in study and suggest the hybridization with the complementary target. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Mestre em Química Eletrodos modificados com filmes poliméricos são matrizes eficientes para a
imobilização de biomoléculas. Devido à funcionalização aniônica ou catiônica da
superfície, eles promovem a repulsão eletrostática de interferentes e interação eficiente
com a biomolécula imobilizada. Desta forma, os EQM impulsionam grande avanço no
desenvolvimento de biossensores e sensores.
Visando a incorporação de nucleotídeos, oligonucleotídeos e fragmentos de
DNA foram feitos estudos sobre a eletropolimerização do monômero ácido 4-
hidroxifenilacético (4-HFA) sobre eletrodo de grafite, para se obter a melhor condição
de polimerização e caracterização da superfície. Em valores de pH ácido, foi observada
a formação de filmes com maior caráter eletroativo e que facilitam a transferência de
elétrons frente ao par redox K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6. A caracterização desses filmes, por
meio de MFA e MEV, confirmou a deposição de material polimérico sobre a superfície.
Estudos de eletrooxidação e otimização de guanosina monofosfato e adenosina
monofosfato imobilizadas sobre filmes de poli(4-HFA) foram realizados em diferentes
valores de pH. A variação das condições experimentais, particularmente o pH do
eletrólito, mostraram que o potencial de oxidação de AMP e GMP imobilizados sobre
poli(4-HFA) decresceram com o aumento de valores de pH da solução. Maiores valores
de corrente de oxidação foram obtidas para AMP em tampão fosfato (pH 7,5) e GMP
em tampão acetato (pH 4,5).
A imobilização e detecção de oligonucleotídeos de 16 pb foram realizadas em
matrizes de poli(4-HFA). No processo de detecção com o alvo complementar foi
observado decréscimo nos valores de corrente, quando comparados com a resposta
obtida antes da hibridização.
A magnitude do sinal de corrente da eletrooxidação dos nucleotídeos e
oligonucleotídeos foi maior para os eletrodos de grafite modificados com poli(4-HFA),
mostrando a eficiência da cobertura polimérica. A amplitude do sinal de corrente é um
importante parâmetro para garantir a sensibilidade dos biossensores.
A hibridização com os fragmentos de DNA do vírus da dengue (DEN-1) foi feita
utilizando brometo de etídio como indicador da hibridação. A formação de dsDNA foi
monitorada por meio do aumento no sinal de corrente, provocado pelo acúmulo do
intercalador sobre a superfície do eletrodo.
Imagens da topografia da superfície por MFA indicam que a imobilização de
DEN-1 (ssDNA) sobre a matriz polimérica resulta em diminuição da rugosidade e, após
a hibridização com o alvo complementar (dsDNA), observou-se a formação de maior
número de glóbulos. As imagens de MFA comprovam a imobilização das biomoléculas
em estudo, bem como, sugerem a hibridização com o alvo complementar.