Dissertação
Caracterização bioquímica e funcional de uma Fosfolipase A2 isolada da peçonha de Bothrops alternatus
Registro en:
Autor
Paschoal, Tamires dos Santos
Institución
Resumen
The phospholipases A2 (PLA2s) are part of a superfamily of proteins with similar enzymatic
functions, responsible for the hydrolysis of phospholipids and, thus, for the release of fatty
acids and lysophospholipids which play a role in various physiological activities, like
inflammation, platelet activation, signaling, cell proliferation and migration. The present
study aimed at the functional and biochemical characterization of an acidic phospholipase A2
isolated from the Bothrops alternatus snake venom, named BaG2P5. BaG2P5 was purified
using three chromatographic steps: ion exchange on DEAE-Sephacel, molecular exclusion in
Sephadex-G75 and hydrophobic interactions in Phenyl-Sepharose. The mass spectrometry
was used to determine the purity and the molecular mass of BaG2P5, which was
approximately 14 kDa. The protein showed a potent time and dose-dependent phospholipasic
activity, evaluated by indirect hemolysis method, and was able to cause muscle tissue damage
and leukocyte recruitment when intramuscularly administered. In addition, BaG2P5 presented
in vitro toxicity against HeLa cells, and inhibited platelet aggregation induced by epinephrine
in a time and dose dependent manner. On the other hand, BaG2P5 could not induce
intraplantar edema and hyperalgesia in rat paws. These results contribute for studies on snake
venom composition and for better understanding of the role of phospholipases in snake
envenoming. Furthermore, the characterization of toxins with anti-platelet and anti-cancer
properties is an important step in the discovery of new molecules with therapeutic potential. Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Mestre em Biologia Celular e Estrutural Aplicadas As fosfolipases A2 pertencem a uma superfamília de proteínas com funções enzimáticas
semelhantes, responsáveis pela hidrólise de fosfolipídeos e, assim, pela liberação de ácidos
graxos e lisofosfolipídeos que participam de diversas atividades fisiológicas, como
inflamação, ativação plaquetária, sinalização, proliferação e a migração celular. O presente
trabalho teve como objetivo a caracterização bioquímica e funcional de uma fosfolipase A2
ácida isolada da peçonha de Bothrops alternatus, denominada BaG2P5. A proteína BaG2P5
foi purificada por meio de três passos cromatográficos em resinas de troca iônica (DEAESephacel),
exclusão molecular (Sephadex G75) e interação hidrofóbica (Phenyl-Sepharose). A
espectrometria de massas foi utilizada para determinação do grau de pureza e da massa
molecular de BaG2P5, que foi de aproximadamente 14 kDa. BaG2P5 apresentou uma potente
atividade fosfolipásica tempo e dose-dependentes, avaliada pelo método de hemólise radial
em gel, e foi capaz de causar lesão do tecido muscular e recrutar leucócitos quando injetada
intramuscularmente em camundongos. Além da miotoxicidade, BaG2P5 apresentou
toxicidade in vitro sobre culturas de células da linhagem tumoral HeLa, e também efeito
inibitório tempo e dose-dependentes sobre a agregação plaquetária induzida por epinefrina.
Por outro lado, BaG2P5 não foi capaz de induzir a formação de edema nem a hiperalgesia
quando injetada na região intraplantar da pata de ratos. Esses resultados contribuem para os
estudos sobre a composição das peçonhas de serpentes e para melhor compreensão do papel
das fosfolipases A2 nos envenenamentos ofídicos. Além disso, a caracterização de toxinas
com efeitos antiplaquetário e antitumoral é uma etapa importante para a descoberta de novas
moléculas com potencial terapêutico.