Dissertação
Imobilização e estabilização de β-galactosidase por ligações multipontuais em Duolite A568
Imobilização e estabilização de β-galactosidase por ligações multipontuais em Duolite A568
Registro en:
Autor
Falleiros, Larissa Nayhara Soares Santana
Institución
Resumen
β-galactosidase has presented increased use in the dairy industry, since it can be used to
produce a isomolecular mixture of glucose and galactose and also has wide application in
biotechnological production of milk with a low-lactose content and in production of galactooligosaccharides
from whey lactose, which is abundantly available as a byproduct of the
dairy industry. Having a great interest in the stabilization by multipoint covalent attachment
of the enzyme immobilized, since these bonds can increase stiffness of the enzyme and,
therefore, increase the stability against inactivating agents. In this work was studied the
immobilization and stabilization of β-galactosidase using as carrier the ion exchange resin
Duolite A568, with and without cross-linking using glutaraldehyde. The immobilization
process was constituted by adsorption of the enzyme in Duolite A-568 and the stabilization
procedure was performed by incubation of the biocatalyst in buffer pH 9 at 25 ° C ± 1 ° C for
24h. Was evaluated the influence of the steps s order to obtain the immobilized biocatalyst, as
well as the influence of buffer used and the presence of the substrate in the process of
obtaining biocatalyst. The stability of the biocatalyst obtained was evaluated with respect to
pH, temperature and storage. The immobilized enzyme was packed in a fixed bed reactor with
recycle operating in continuous, in order to assess the hydrolysis process this type of reactor
as a function of recycle ratio used. Was studied the operational stability of the biocatalyst
during 800 residence time in the reactor. The results indicated that the production s method to
immobilize β-galactosidase from Aspergillus oryzae on Duolite A568 which improvement the
catalytic activity was the result of the immobilization process by adsorption, followed by
stabilization step, and finally subjected to the process of cross-linking with glutaraldehyde,
promoting an increase of 44% enzyme activity compared with the activity achieved by the
biocatalyst obtained by the processes of adsorption and cross-linking. The use of borate buffer
reduced the activity by approximately 70% compared with the activity obtained by using
phosphate buffer. The addition of lactose as a protective compound the active site of the
enzyme during immobilization did not alter the performance of the biocatalyst, showing that
the active site is not directly involved in the process of immobilization. The biocatalyst
obtained by the combination of adsorption processes, stabilization, and crosslinking was
highly stable over the entire pH range studied. It was observed a strong dependence of the
immobilized enzyme in relation to temperature. At temperatures of 60, 57,5 and 55 °C there
was a level of stability to the 30 minutes of incubation, from there one can observe the
thermal inactivation process. At 55 °C after 140 minutes, the biocatalyst retained 77% its
activity relative to baseline.The model of thermal deactivation of the first order was the best
fit to the experimental results to describe the kinetics of thermal deactivation of the
immobilized enzyme. The activation energy of thermal deactivation process of β-
galactosidase from Aspergillus oryzae immobilized was 71,03 kcal/mol with half-lives of 5,5
hours at 55 °C. The immobilized enzyme retained its activity after 100 days of storage in
acetate buffer pH 4.5 at 4 ± 2 ° C. The recycle ratio of 0,5 promoted an increase of
approximately 40% of the overall conversion as compared to the conversion per pass achieved
for the same operating condition. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Mestre em Engenharia Química A enzima β-galactosidase tem apresentado uso crescente na indústria de laticínios, visto que a
mesma pode ser utilizada para produzir uma mistura isomolecular de glicose e galactose, além
de possuir uma grande aplicação biotecnológica na produção de leite com baixo teor de
lactose e na produção de galacto-oligossacarídeos a partir da lactose do soro, que está
disponível em abundância como um subproduto da indústria de queijo. Tem-se ainda um
grande interesse na estabilização da enzima imobilizada através de ligações covalentes
multipontuais, visto que estas ligações podem aumentar a rigidez da enzima e, por
consequência, aumentar a estabilidade frente a agentes inativantes. Neste trabalho foram
estudadas a imobilização e estabilização de β-galactosidase em resina de troca iônica, com e
sem cross-linking, utilizando glutaraldeído. O processo de imobilização consistiu na adsorção
da enzima na resina de troca iônica Duolite A-568 e a estabilização do derivado enzimático
foi realizado através da incubação do mesmo em tampão pH 9 a 25°C ± 1°C por 24h. Foi
avaliada a influência da ordem das etapas de obtenção do biocatalisador imobilizado, bem
como a influência do tampão utilizado e o efeito da presença do substrato no processo de
obtenção do mesmo. A estabilidade do biocatalisador obtido foi avaliada em relação ao pH, à
temperatura e à estocagem. A enzima imobilizada foi empacotada em um reator de leito fixo
com reciclo operando em regime contínuo, com intuito de avaliar o processo hidrólise neste
tipo de reator em função da razão de reciclo utilizada. Estudou-se a estabilidade operacional
do biocatalisador durante 800 tempos de residência em reator contínuo. Os resultados
indicaram que o método de obtenção de β-galactosidase de Aspergillus oryzae imobilizada em
Duolite A568 que resultou na maior atividade catalítica foi a sequência dos processos de
imobilização por adsorção, seguido da etapa de estabilização e finalmente submetida ao
processo de ligação cruzada com glutaraldeído, promovendo um aumento de 44% da
atividade enzimática, quando comparado com a atividade alcançada pelo biocatalisador obtido
pelos processos de adsorção e cross-linking. O emprego do tampão borato reduziu a atividade
em aproximadamente 70% quando comparado com a atividade do derivado obtido utilizando
tampão fosfato. A adição da lactose como composto protetor do sítio ativo da enzima durante
a imobilização não alterou o desempenho do biocatalisador, mostrando que o sítio ativo não
está diretamente envolvido no processo de imobilização. O biocatalisador obtido pela
combinação dos processos de adsorção, estabilização e ligação cruzada mostrou-se altamente
estável em toda a faixa de pH estudada. Foi verificada uma forte dependência da enzima
imobilizada em relação à temperatura. Para as temperaturas de 60, 57,5 e 55°C foi observado
um patamar de estabilidade até os 30 minutos de incubação, a partir daí observa-se o processo
de inativação térmica. Para a temperatura de 55°C, após 140 minutos o biocatalisador reteve
77% da atividade em relação à inicial. O modelo de desativação térmica de primeira ordem
foi o que melhor se ajustou aos resultados experimentais para descrever a cinética de
desativação térmica da enzima imobilizada. A energia de ativação do processo de desativação
térmica de β-galactosidase de Aspergillus oryzae imobilizada foi 71,03 kcal/mol com tempos
de meia vida de 5,5 horas a 55°C. A enzima imobilizada manteve sua atividade após 100 dias
de armazenamento, em tampão acetato pH 4,5 a 4 ± 2°C. A razão de reciclo igual a 0,5
promoveu um incremento de aproximadamente 40% da conversão global quando comparado
como a conversão por passe alcançada para a mesma condição de operação.