ABSTRACT - CHAPTER I With the aim of guarantee the stability of the biological organization complexes, nature uses several mechanisms, as the control of pH, temperature and concentration of solutes in the internal medium. The control of the solute concentration contributes to what we can call as osmostabilization. This paper tries to apply the known theories about the stabilization of proteins now on the biological membranes. The osmostabilizing solutes, also called as osmolytes, increase the free energy of the native state (N), but increase much more the free energy of the unfolded state (D) of a protein, in such a way that the osmolytes stabilize the N state of a protein by the increase in free energy barrier between the states, which makes less probable the unfolding and the loss of the protein function. The reason of this difference would be in the preferential interaction of the protein with the water. The protein prefers binds to water than to the osmolyte, which is then excluded from the inner hydration shell of the protein surface, according an effect that was designated as solvophobic or osmophobic effect. The larger contact surface of the D state requires a higher investment of free energy for its hydration, beyond a better organization of the water molecules around the external surface, in such a way that the conformational entropy of the solvent is lower around the D state than it is around the N state. This means that the osmolytes stabilize the native state in relation to the unfolded state of the protein. The biological membranes have an important aspect of their structures in common with water soluble proteins. They also hide their hydrophobic groups in their anhydrous interior, constituted by a phospholipids bilayer, in which the polar heads of these lipids make contact with the aqueous surrounding in the external and internal media of the biological structure encompassed by the membrane. The erythrocytes constitute a very valid model to study the behavior of the membranes. The utilization of osmolytes increases the stability of erythrocytes preparations and permits even their cryopreservation. In the presence of osmolytes the erythrocytes suffer reversible morphological alterations with volume decrease. Thus, the erythrocytes will exist in an equilibrium process between two states, an expanded (R) and a compact one (T), where T is the more stable state. In this study, we tentatively explained this larger stability of the T state of the erythrocytes with basis in the preferential hydration theory of Timasheff. ABSTRACT - CHAPTER II The erythrocyte constitutes a very adequate model to study the stability of biological membranes, since the rupture of its membrane promotes release of hemoglobin, which capacity to adsorb light in the visible region of the spectra permits the monitoration of the membrane denaturation. In this work, we studied the effect of the presence of sorbitol on the thermal dependence of the stability of human erythrocytes against the denaturant action of ethanol in 0,9% NaCl. The membrane denaturation was monitored by the measurement of the absorbance at 540 nm (A540 nm). The dependence of A540 nm with the ethanol concentration in 0.9% NaCl, in the absence and presence of 1 mol.L-1 sorbitol, was studied at 27, 32, 37 and 42 °C. After complete denaturation of the erythrocytes, the A540 nm values were converted in percentage of hemolysis. All the dependencies of the % of hemolysis with the concentration of ethanol followed sigmoidal transition lines, which were adjusted to the Boltzman equation, in order to determine the concentration of ethanol able to promote 50% of hemolysis (D50). The incorporation of 1 mol.L-1 sorbitol promoted statistically significant decreases (P<0.01) in the D50 values, for all considered temperatures. The increase in the temperature also promoted statistically significant decreases (P<0.01) in the D50 values in the absence and in the presence of sorbitol. The values of D50 presented a linear dependence with the temperature. The slope of that line in the presence of sorbitol was significantly smaller (P<0.01) than it was in absence of that solute. This means that the presence of 1 mol.L-1 sorbitol increases the chaotropic action of ethanol, at the same time that it presents a stabilizing action, which increase with an increase in the temperature. If we assume linearity beyond the interval of 27 and 42 °C, those regression lines will intercept around 68.8 °C, where the stabilizing effect of sorbitol would neutralize its synergism with the chaotropic action of ethanol. These effects were explained with basis in a two state equilibrium model for the erythrocyte, a less stable expanded state and a more stable contracted state. The rationality of the model is discussed. Whatever is the adopted explanation, our results permit conclude that 1 mol.L-1 sorbitol, in the presence of 0.9% NaCl, increases the chaotropic action of ethanol and temperature on the erythrocyte membrane, although it does not present any chaotropic action itself between 0 and 1.5 mol.L-1, by the same time that it also presents a stabilizing action on the membrane that increases with the increase in the temperature.Mestre em Genética e BioquímicaRESUMO - CAPITULO I Na tentativa de garantir a estabilidade dos complexos organizacionais biológicos, a natureza emprega vários mecanismos, como o controle do pH, da temperatura e da concentração de solutos no meio interno. O controle da concentração de solutos contribui para o que podemos chamar de osmoestabilização. Esse trabalho procura aplicar teorias conhecidas para a estabilização de proteínas agora sobre as membranas biológicas. Os solutos osmoestabilzadores, também chamados de osmólitos, aumentam a energia livre do estado nativo (N), mas aumentam muito mais a energia livre do estado desenovelado (D) de uma proteína, de tal forma que os osmólitos estabilizam o estado N de uma proteína pelo aumento da barreira de energia livre entre eles, o que torna menos provável o desenovelamento e a perda de função da proteína. A razão dessa diferença estaria na interação preferencial da água com a proteína. A proteína prefere ligar-se à água do que ao osmólito, que é então excluído da esfera de hidratação mais próxima à superfície da proteína, segundo um efeito que foi denominado de solvofóbico ou de osmofóbico. A maior superfície de contato do estado D exige um maior investimento de energia livre para sua hidratação, além de uma maior organização das moléculas de água em torno de sua superfície externa, de tal forma que a entropia conformacional do solvente é menor em torno do estado D do que do estado N. Isso significa que o osmólito estabiliza o estado nativo em relação ao estado desnaturado de uma proteína. As membranas biológicas têm um aspecto importante de sua estrutura em comum com as proteínas solúveis em água. Elas também escondem seus grupos hidrofóbicos em um interior anidro, constituído por uma bicamada de fosfolipídios, em que as cabeças polares desses lipídios fazem contato com o meio externo e interno da estrutura biológica circundada pela membrana. Os eritrócitos constituem um modelo muito válido para estudo do comportamento de suas membranas. A utilização de osmólitos aumenta a estabilidade de soluções de eritrócitos e permite inclusive sua criopreservação. Na presença de osmólitos os eritrócitos sofrem alterações morfológicas reversíveis com a diminuição de volume. Assim, os eritrócitos existem numa situação de equilíbrio entre dois estados, um estado expandido (R) e um estado condensado (T), onde T é o estado de maior estabilidade. Neste trabalho nós explicamos tentativamente essa maior estabilidade do estado T dos eritrócitos com base na teoria da hidratação preferencial de Timasheff. RESUMO - CAPÍTULO II O eritrócito constitui um modelo muito adequado para estudo da estabilidade de membranas, uma vez que a ruptura de sua membrana promove liberação de hemoglobina, cuja absorção de luz na região do visível permite a monitoração da desnaturação da membrana. Neste trabalho nós estudamos o efeito da presença de sorbitol sobre a dependência térmica da estabilidade de eritrócitos humanos contra a ação desnaturante do etanol em NaCl 0,9%. A desnaturação da membrana foi monitorada pela medida da absorvância em 540 nm (A540 nm). A dependência de A540 nm com a concentração de etanol em solução de NaCl a 0,9%, na ausência e na presença de sorbitol a 1 mol.L-1, foi estudada a 27, 32, 37 e 42 °C. Após desnaturação completa dos eritrócitos, os valores de A540 nm foram convertidos em percentagem de hemólise. Todas as dependências da % de hemólise com a concentração de etanol seguiram linhas de transição sigmoidal, que foram ajustadas à equação de Boltzman, para determinação da concentração de etanol capaz de promover 50% de hemólise (D50). A incorporação de sorbitol a 1 mol.L-1 promoveu declínios estatisticamente significantes (P<0,01) nos valores de D50, em todas as temperaturas consideradas. O aumento da temperatura promoveu declínios também estatisticamente significantes (P<0,01) nos valores de D50 tanto na ausência quanto na presença de sorbitol. Os valores de D50 apresentaram uma dependência linear com a temperatura. A inclinação da reta de dependência térmica de D50 na presença de sorbitol foi significativamente menor (P<0,01) do que na ausência do osmólito. Isso significa que o sorbitol a 1 mol.L-1 aumenta o efeito caotrópico do etanol, ao mesmo tempo em que apresenta uma ação estabilizadora que é tanto maior quanto maior é a temperatura. Assumindo linearidade além do intervalo de temperatura de 27 a 42 °C, as duas linhas de regressão devem sofrer uma intersecção em torno de 68,8 °C, ponto em que a ação estabilizadora do sorbitol neutralizaria seu sinergismo com a ação caotrópica do etanol. Esses efeitos foram explicados de acordo com um modelo de equilíbrio em dois estados para o eritrócito, um estado expandido de menor estabilidade e um estado contraído de maior estabilidade. Independentemente da explicação adotada, nossos resultados permitem concluir que, a 1 mol.L-1 e na presença de NaCl a 0,9%, o sorbitol acentua a ação caotrópica do etanol e da temperatura, entre 27 e 42 °C, sobre a membrana do eritrócito, embora ele não tenha ação caotrópica entre 0 e 1,5 mol.L-1, ao mesmo tempo em que também promove estabilização da membrana, numa intensidade que aumenta com o aumento da temperatura.