Tese
Avaliação dos níveis de anticorpos, citocinas e mirnas em pacientes com rinite mediada e não mediada por anticorpos IgE
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Autor
Miranda, Juliana Silva
Institución
Resumen
Allergic rhinitis with symptomatology and IgE (S-IgE+) is a classical disease with a pattern
of inflammation of the upper airways well characterized by Th2 pathway regulation.
However, the rhinitis with symptomatology triggered by house dust exposure and no
systemic IgE (S-IgE-) is involved by an unknown IgE- independent mechanism, which is not
well understood yet. The aims of this study were to investigate antibody responses to house
dust mite (HDM) Dermatophagoides pteronyssinus (Dp), cytokine levels, relative expression of
mRNA cytokines and microRNA (miRNA) in patients and control (CT) subjects. Three
groups of subjects divided in S-IgE+ (n = 32), S-IgE- (n = 19), and CT (n = 31) by clinical
symptoms, skin prick test (SPT) and levels of specific IgE to Dp were analyzed. Blood
samples were collected and sera were used to measure IgG1, IgG3, IgG4, and IgA specific to
crude Dp allergen extract by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Peripheral blood
mononuclear cells (PBMCs) from subjects (S-IgE+, 15; S-IgE-, 11; CT, 10) were isolated and
stimulated with mitogen (phytohemagglutinin-PHA), crude Dp allergens extract, and
medium alone for control. Supernatants were collected after 4 days to evaluate the cytokine
levels, and cells were harvested for RNA extraction to assess the relative expression of
cytokines and miRNA by reverse transcription PCR (RT-qPCR). Specific IgE and IgG4 anti-
Dp showed seropositivity rate significantly higher in S-IgE+ than S-IgE- or CT subjects.
Specific IgG3 to Dp showed significant higher levels in S-IgE+ than CT group. Levels of Dpspecific
IgA and IgG1 showed no significant difference among the groups. The cytokine IL-5
was significantly higher in cell culture supernatants after Dp stimulation from S-IgE+
patients than S-IgE- or CT subjects. However, levels of IL-4, IL-10, IL-13, IL-17 and IFN-γ
were not significantly different among groups, as well as the cytokine levels in sera,
including IL-5. Relative expression of IL-5, IFN-γ and TGF-β in PBMCs stimulated with Dp
allergens showed significant values, with higher levels of IL-5 in S-IgE+ compared to S-IgEand
CT groups; IFN-γ showed higher expression in S-IgE+ when compared to CT; and TGF-β
presented higher expression in S-IgE- group. miRNAs relative expression was similar among
groups. In the overall, our data suggested that S-IgE- patients showed serum antibodies,
cytokines in the supernatant of the cell culture stimulated with Dp allergens and in sera
more similar to CT individuals than to S-IgE+, although the symptoms in S-IgE- patients
were triggered after house dust exposure like S-IgE+ patients, demonstrating that the
mechanism of the antibody and cytokine responses are quite different between S-IgE- and SIgE+
groups. In addition, the relative expression of IL-5, IFN-γ and TGF-β was quite different
of seen in cytokine levels measure, explained by the difference between the relative
expression of gene and its protein. For miRNA in PBMCs stimulated with Dp allergens were
not significantly different among the three groups, and a reason could be the small sample
tested. Our findings showed that antibody, cytokine and miRNAs profiles analyzed in this
study were not able do discriminate these groups, additional studies will be needed for
elucidation of the real immunopathogenic mechanisms of this complex S-IgE- group of
patients. Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas A rinite alérgica é uma doença com padrão de resposta clássico que apresenta sintomatologia
e IgE (S-IgE+), caracterizada por inflamação das vias aéreas superiores regulada pelo perfil
Th2. Contudo, existe outro quadro de rinite que também apresenta sintomatologia
desencadeada por exposição a poeira domiciliar, mas sem a presença de IgE (S-IgE-)
sistêmica, demonstrando um mecanismo independente de IgE envolvido e ainda não
compreendido. Os objetivos do presente trabalho foram investigar a resposta anticórpica ao
ácaro da poeira domiciliar Dermatophagoides pteronyssinus (Dp), os níveis de citocinas e a
expressão relativa do RNAm para citocinas e microRNAs (miRNAs) nos pacientes e
indivíduos controle (CT). Os indivíduos foram divididos em três grupos S-IgE+ (n = 32), SIgE-
(n = 19) e CT (n = 31) por meio dos sintomas clínicos, teste cutâneo de puntura (TCP) e
níveis séricos de IgE específica a Dp. Amostras de sangue foram coletadas e o soro utilizado
para mensurar IgG1, IgG3, IgG4 e IgA específicas ao extrato alergênico bruto de Dp pelo
imunoensaio enzimático (ELISA). Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) dos
grupos (S-IgE+, 15; S-IgE-, 11; CT, 10) foram isoladas e estimuladas com mitógeno
(fitohemaglutinina PHA), extrato bruto de Dp e somente com meio para controle. O
sobrenadante foi coletado depois de 4 dias para avaliar os níveis de citocinas, e as células
foram utilizadas para extração de RNA para a avaliação da expressão relativa das citocinas e
miRNAs por reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR). Os níveis de IgE e
IgG4 específicos a Dp apresentaram soropositividade significantemente maiores nos
pacientes do grupo S-IgE+ comparados aos grupos S-IgE- e CT. A dosagem de IgG3
específica a Dp mostrou níveis significantemente maiores no grupo S-IgE+ somente quando
comparada ao grupo CT. Níveis de IgA e IgG1 não apresentaram diferença significante entre
os grupos. Se por um lado os níveis de IL-5 no sobrenadante de cultura foram maiores no
grupo S-IgE+ e com diferença estatística quando comparados aos outros grupos, por outro
lado não foi observada diferença significante nos níveis de IL-4, IL-10, IL-13, IL-17 e IFN-γ
entre os grupos, assim como os níveis das citocinas dosadas no soro incluindo a IL-5. A
expressão relativa de IL-5, IFN-γ, TGF-β e miRNA em PBMCs estimuladas com alérgenos de
Dp mostrou valores significantes, com valores de IL-5 aumentados no grupo S-IgE+ quando
comparados aos valores dos grupos S-IgE- e CT; IFN-γ apresentou valor maior e significante
no grupo S-IgE+ apenas quando comparado ao grupo CT e TGF-β foi mais expressivo no
grupo S-IgE-. A expressão relativa dos miRNAs (miR-21 e miR-126) não mostrou diferença
significante. Nossos dados sugerem que houve maior similaridade nos níveis de anticorpos e
citocinas no sobrenadante de cultura de células estimuladas com Dp e no soro entre os
pacientes S-IgE- e o grupo CT do que com o grupo S-IgE+, apesar dos sintomas nos pacientes
S-IgE- serem desencadeados depois da exposição a poeira domiciliar assim como nos
pacientes S-IgE+, demonstrando que o mecanismo da resposta por anticorpos e citocinas é
diferente entre os grupos S-IgE- e S-IgE+. Além disso, a expressão relativa das citocinas
mostrou diferenças o que foi parcialmente visto na dosagem das citocinas, o que pode ser
explicado pela diferença que ocorre entre a tradução e transcrição das proteínas. Não foi
observada diferença na expressão relativa dos miRNAs, sendo que uma possível causa seria
devido ao reduzido número de amostras testadas. Desta forma, nossos dados mostraram que
os perfis de anticorpos, citocinas e miRNAs analisados neste estudo não foram capazes de
discriminar estes grupos, assim estudos adicionais serão necessários para elucidar o real
mecanismo imunopatogênico deste complexo grupo de pacientes do grupo S-IgE-.