O gênero Astyanax inclui peixes de pequeno porte até 200 mm, vulgarmente conhecido como lambaris, comuns nas bacias hidrográficas neotropicais.As últimas revisões registram mais de 100 espécies nas águas continentais brasileiras para o gênero Astyanax, com relações filogenéticas indeterminadas dentro da família Characidae. Este gênero revela espécies morfologicamente muito semelhantes e com grande variabilidade cariotípica dentro e entre bacias hidrográficas, formando um grupo altamente complexo ao nível taxonômico e citogenético, o que foi interpretado como evidência de existência de complexos de espécies dentro do gênero. Este trabalho teve por objetivo utilizar ferramentas da citogenética para estudar populações do complexo Astyanax bimaculatus em três bacias adjacentes brasileiras: no rio Meia Ponte (Bacia do Alto Paraná), no rio Mutum (Bacia Araguaia) e no córrego São José e rio Sepotuba (Bacia do Alto Paraguai). Os estudos cromossômicos seguiram os protocolos básicos para as principais técnicas citogenéticas As populações estudadas de Astyanax altiparanae, Astyanax aff. argyrimarginatus e Astyanax asuncionensis apresentaram número diplóide de 2n=50 e apenas uma população de A. asuncionensis do córrego São José apresentou 2n=48. Nenhuma das populações estudas apresentaram diferenciação de cromossomos sexuais.Os resultados encontrados demonstraram pequenas variações cariotípicas entre as populações das três bacias que sugerem a influência seletiva ou de gargalos derivados da complexa história de eventos de dispersão e vicariância característicos dessa região.The Astyanax genus includes small fish up to 200mm, commonly known as lambaris, which are widespread in Neotropical hydrographic basins. The latest reviews recorded over 100 species in the Brazilian continental waters for the genus Astyanax, with the uncertain position inside the family Characidae. This genus has species morphologically very similar with great karyotypic variability within hydrographic basins, forming taxonomically undefined groups that were interpreted by some authors as evidence for the existence of some species complex. This study aimed to apply the cytogenetic approach to study populations of the "Astyanax bimaculatus" complex in three adjacent Brazilian, as a contribution to understanding the genetic diversity of the group. The specimens were collected in the Meia Ponte River (Upper Paraná Basin) in the Mutum River (Araguaia Basin), in the São José Stream and the Sepotuba River (Upper Paraguay River Basin). Chromosome studies included standard cytogenetic techniques. Populations of Astyanax altiparanae, Astyanax aff. argyrimarginatus and Astyanax asuncionensis showed a diploid number of 2n = 50 and only one population of A. asuncionensis stream San Jose had 2n = 48. None of the studied populations showed differentiation of sex chromosomes. The results showed small karyotypic variation among populations of the three basins that may be related to the complex dispersal and vicariance events that characterize this region.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior