Objective: To compare and evaluate four different methods of bacterial DNA extraction. Methods: We use control strains of Gram-negative and Gram-positive bacteria for DNA extraction by the following methods: boiling, alkaline lysis, in house kit and commercial kit. We compare the results of quantitative and qualitative analyses, real time PCR efficiency, time, reproducibility and cost. On quantitative and qualitative analyses we observe some variations in results obtained for each strain and method, however, boiling, alkaline lysis and in house kit showed similar purity. Real time PCR results confirmed the efficiency of all methods tested. Results: Regarding time, reproducibility and cost the boiling method stood out with good results. Conclusion: The alkaline lysis method achieved better performance presenting excellent PCR amplifications, good DNA amounts, satisfactory purity, ideal time and cost and reproducibility acceptable for both Gram-positive and Gram-negative bacteria, being a very interesting option for application on laboratory routine.Objetivo: Comparar e avaliar quatro diferentes métodos de extração de DNA bacteriano. Métodos: Foram utilizadas cepas de bactérias Gram positivas e Gram negativas para extração do DNA pelos seguintes métodos: fervura, lise alcalina, kit in house e kit comercial; de modo a comparar os resultados referentes as análises quantitativas e qualitativas, eficiência na PCR em tempo real, tempo, reprodutibilidade e custo. Resultados: Na análise quantitativa e qualitativa, pode-se observar que houve variações em relação aos resultados obtidos para cada amostra e para cada extração, no entanto, os métodos de fervura, lise alcalina e do kit in house apresentaram, em geral, purezas semelhantes. Já nos resultados obtidos pela PCR em tempo real todos os métodos se mostraram eficientes. Ainda, em relação ao tempo, reprodutibilidade e custo o método por fervura se destacou nos três comparativos. Conclusão: Pode-se perceber que o método de lise alcalina ganhou destaque em todos os comparativos avaliados, apresentando amplificações excelentes na PCR, boas quantidades de DNA, pureza satisfatória, tempo ideal e custo e reprodutibilidade consideráveis, tanto para bactérias Gram positivas como Gram negativas, sendo uma opção interessante para aplicação na rotina laboratorial.