Article
Desenho e Validação de Primers In Silico para Detecção do Vírus Sincicial Respiratório Humano
Design and Validation of Primers In Silico for Detection of Human Respiratory Syncytial Virus
Registro en:
QUEIROZ, Jackson Alves da Silva et al. Desenho e Validação de Primers In Silico para Detecção do Vírus Sincicial Respiratório Humano. Revista FIMCA, v. 4, n. 1, p. 17-30, 2017.
Autor
Queiroz, Jackson Alves da Silva
Alves, Luciane Soares
Dall’acqua, Deusilene Souza Vieira
Souza, Luan Felipo Botelho
Resumen
Introdução: O desenvolvimento de primers é extremamente importante
para pesquisas moleculares. Objetivos: O presente estudo objetivou
desenhar e validar primers in silico para detecção do vírus sincicial
respiratório humano (RSVH). Materiais e Métodos: Foi construído um
banco de 100 sequências de genoma completo do Vírus Sincicial
Respiratório Humano (RSVH) depositadas no Genbank (NCBI). Realizado
um alinhamento múltiplo global utilizando o algoritimo Clustal W,
mapeadas as regiões conservadas e selecionado os primers.
Posteriormente submetidos à análise dos parâmetros especificidade, pela
ferramenta BLAST, concentração de GC%, TMelting, comprimento,
formação de dímeros e hairpin utilizando o software Oligo Analyser,
validando-os para uso in vitro. Para discussão dos resultados, foram
selecionados 14 primers de estudos realizados, submetidos à metodologia
proposta neste estudo, comparando os dados obtidos. A região alvo
escolhida foi o gene da Glicoproteína G, pela presença de sítios
conservados. Resultados: Os primers amplificam um fragmento de 381pb,
que submetido a uma segunda PCR, resulta em 109 pb correspondente ao
tipo A do vírus e 168 pb para o tipo B, permitindo a detecção viral e a
distinção de genótipos. Os primers possuem tamanho de 21 a 24 pb, com
uma temperatura de melting entre 48,9º C e 55,3º C. A concentração de
GC% varia de 33,3% a 52,4%. O número de bases complementares na
análise de dímeros e hairpin manteve-se abaixo de 5 bases. A Energia
Livre de Gibbs (Delta G) acima de -9 kcal.mole(-1) como desejado.
Conclusão: Os valores obtidos na validação dos primers estão em
concordância com os já utilizados em estudos de referência, validando
assim o seu uso in vitro. Palavras-chave: Desenho de primers.
Bioinformática. Vírus Sincicial Respiratório. Análise In Silico. Dímeros.
Hairpin. Introduction: Developing primers is extremely important to molecular
researches. Objectives: This study aims to drawing and validate in silico
primers for detection of Human Respiratory Syncytial Virus (RSVH).
Materials and Methods: It was built a database of 100 complete genome
sequences of Human Respiratory Syncytial Virus (RSVH) deposited in the
Genbank (NCBI), carried out a global multiple alignment using the
algoritm Clustal W, thus mapping the conserved regions, and selecting
primers, subsequently submitted to analysis of parameters such as
specificity, by the BLAST tool, concentration of GC% TMelting, length, and
formation of dimers and hairpins using the software Oligo Analyser,
validating them to use in vitro. For discussion of the results, we selected
14 primers of studies already carried out and submitted the methodology
proposed in this study, comparing the data obtained. The selected target
region was the gene encoding the Glycoprotein G, by the presence of
conserved sites. Results: The primers selected amplifies a fragment of 381
bp in the 1st PCR, which subjected to a second PCR results in 109 bp
corresponding to the type A of the virus and 168 base pairs for the type
Bwhat allows not only viral detection, as the distinction of the type to
which it belongs. The primers have size from 21 to 24 base pairs, having a
melting temperature (Tmelting) between 48,9º C and 55,3º C and GC%
concentration ranging from 33.3% to 52.4%. The number of
complementary bases in the dimers and hairpins analysis was maintained
below 5 bases, while the Gibbs free energy (Delta G) was kept above
kcal.mole -9(-1) as desired. Conclusion: All values obtained in the
validation of the primers are in agreement with the ones already used in
the reference studies, thereby validating its use in vitro.
Key words: Drawing primers, Bioinformatics, Respiratory Syncytial Virus,
In Silico Analysis, Dimers, Hairpin.