O papel do complexo repressor de Polycomb 2 na assinatura epigenética de fatores de transcrição envolvidos na diferenciação de células mesenquinais derivadas tecido adiposo de camundongo obesos

Abstract

A obesidade é uma doença crônica que leva a importantes alterações no tecido adiposo branco (TAB). As células tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (Adipose derived Stromal Cells – AdSC) estão implicadas na expansão do tecido pois são responsáveis por gerar novos adipócitos. O comprometimento das AdSCs com um determinado programa de diferenciação celular depende da ativação e do silenciamento de fatores de transcrição específicos. Foi observado que o TAB de camundongos obesos está enriquecido na marca de trimetilação da lisina 27 da histona 3 (H3K27me3), catalisada pelo Complexo Repressor de Polycomb 2 (PRC2), que leva ao silenciamento de genes. Entretanto, não se sabe se as AdSCs contribuem para esse enriquecimento. As AdSC de camundongos obesos apresentam aumento na capacidade de diferenciação em células ósseas e adiposas. Baseado nesses dados a nossa hipótese é que a obesidade leva a alterações na regulação epigenética de fatores de transcrição nas AdSCs. Para estudarmos estas alterações avaliamos a expressão das subunidades de PRC2 (Ezh2, Suz12 e Eed) e de H3K27me3, por PCR Tempo Real e Western Blot, em AdSC isoladas do TAB subcutâneo e epididimal de animais controle e obeso, induzidos por dieta hiperlipídica (HFD). Apesar de não termos encontrado alteração na expressão de Ezh2, Suz12 e Eed, ou de H3K27me3 nas AdSCs isoladas desses animais, pudemos verificar que a obesidade diminuiu a expressão do fator de transcrição Klf15 em cultura de AdSCs epididimais, enquanto que os fatores de transcrição C/EBPβ e C/EBPδ não apresentaram alteração. Ao tratarmos essas AdSCs com UNC1999, um inibidor competitivo de Ezh2, observamos um aumento da expressão de Klf15. Klf15 é um importante fator de transcrição que participa da ativação de PPAR durante a adipogênese, e as nossas análises de bancos de dados de imunoprecipitação de H3K27me3 em pré-adipócitos 3T3-l1 (GSE21365 e GSE73434) mostraram o enriquecimento dessa marca de silenciamento no promotor desse gene. Esses achados sugerem que Ezh2 silencia Klf15 em AdSCs, e que esse silenciamento é alterado pela obesidade em TAB epididimal. Como não encontramos alteração na quantidade de metilação de H3K27 no núcleo de AdSCs, resolvemos avaliar alterações na sua acetilação (H3K27ac), que caracteriza regiões de ativação da transcrição gênica. Observamos que as AdSCs epididimais sofrem uma importante diminuição em H3K27ac, apesar da expressão de p300, enzima responsável por essa marca, não estar alterada. Portanto, nossos dados sugerem que a obesidade diminui significativamente a expressão do fator de transcrição Klf15, que atua na adipogênese, e diminui também a presença de H3K27ac no núcleo de AdSCs do TAB epididimal. Essas alterações na expressão de fatores de transcrição e de marcas epigenéticas no núcleo de AdSCs podem ter efeitos na proliferação e na adipogênese dessas células afetando a expansão saudável do TAB (hiperplásica) versus expansão patológica do TAB (hipertrófica) em indivíduos obesos.

Obesity is a chronic disease that is related to important changes in white adipose tissue (WAT). Adipose-derived mesenchymal stem cells (AdSC) differentiate in new adipocytes, contributing to WAT growth. The commitment of AdSCs to a specific cell differentiation program depends on the activation and silencing of specific transcription factors. It was observed that the obese mice WAT is enriched in trimethylation H3K27, catalyzed by the Polycomb Repressor Complex 2 (PRC2) silencing genes. However, it is not known whether AdSCs contribute to this enrichment. Obese mice AdSC show an increased ability to differentiate into bone and adipose cells. Based on these data, our hypothesis is that obesity results in alterations in the epigenetic regulation of transcription factors in AdSCs. To study these alteration, was evaluated the expression of PRC2 subunits (Ezh2, Suz12 and Eed) and H3K27me3 by Real Time PCR and Western Blot, in AdSC isolated from subcutaneous and epididymal WAT in control and obese animals, induced by high fat diet (HFD). Although was not found changes in the expression of Ezh2, Suz12 and Eed, or of H3K27me3 in this AdSCs, we could verify that obesity decreased the expression of transcription factor Klf15 in cultured epididymal AdSCs, while transcription factors C/EBPβ and C/EBPδ not changed. These AdSCs were treated with UNC1999, a competitive inhibitor of Ezh2, we observed an increased expression of Klf15. Klf15 is an important transcription factor that participates in PPAR activation during adipogenesis, and our analyzes of H3K27me3 immunoprecipitation databases in 3T3-11 preadipocytes (GSE21365 and GSE73434) showed the enrichment of this silencing mark in promoter of that gene. These findings suggest that Ezh2 silences Klf15 in AdSCs, and that this silencing is altered by obesity in epididymal WAT. Was not found changes in the methylation of H3K27 in the nucleus of AdSCs, we decided to evaluate changes in its acetylation (H3K27ac), which characterizes regions of gene transcription activation. Was observed that epididymal AdSCs undergo an important decrease in H3K27ac, although the expression of p300, the enzyme responsible for this mark, is not altered. Therefore, our data suggest that obesity significantly decreases the expression of the transcription factor Klf15, which acts on adipogenesis, and also decreases the presence of H3K27ac in the nucleus of AdSCs of the epididymal WAT. These changes in the expression of transcription factors and epigenetic markers in the nucleus of AdSCs may have effects on the proliferation and adipogenesis of these cells, affecting healthy TAB expansion (hyperplastic) versus pathological TAB expansion (hypertrophic) in obese individuals.