Identificação e análise de microRNAs possivelmente envolvidos na regulação da via de sinalização celular associada ao processo de angiogênese estimulado por bradicinina e mediada pelo VEGF, EGFR e pelo radical livre NO

Abstract

Angiogenesis is a process that consists in new vessels formation from pre-existing vessels, which results from the activation of the signaling pathways triggered by VEGF, EGF and their receptors associated with NO production, which then regulates and modulates them. The aim of this work was to identify miRs possibly involved in these pathways related to angiogenesis, and whose in vitro model involves the BK stimulation of endothelial cells. For this purpose, the following methodologies were used: expression profile and/or protein activity by Western blot, cell cycle by flow cytometry, estimates of NO concentration by NO analyzer, capillaries formation in Matrigel (in vitro angiogenesis), and miRs expression by miRarray and qRT-PCR. As a result, BK stimulation triggered a signaling pathway consisting of EGFR, VEGF, ERK1 / 2 MAPK and eNOS. Estimates of NO concentration revealed an increase in NO release levels after BK stimulation, and a reduction in NO levels by adding protein inhibitors from the mentioned pathway. Evaluation of expression levels (VEGF and EGFR) and phosphorylation (ERK1/2 MAPK and eNOS) it was observed that BK promoted an increase in expression and/or activity of these, whereas the inhibitors promoted a decrease in expression levels of VEGF and EGFR and phosphorylation of ERK1/2 MAPK and eNOS. Analysis of cell cycle phases revealed that in BK treated cells the population percentage in G2 was higher after 2h. On the other hand, eNOS inhibition by L-NIO reduced this percentage, suggesting that the inhibition, and consequently the reduction in intracellular NO levels, results in the cycle arresting. In evaluating the capillaries formation from endothelial cells seeded in Matrigel, it was found that the formation of these was stimulated by BK and inhibited when the cells were preincubated with pathway specific inhibitors. Through in silico study, 9 pro-angiogenic and 8 anti-angiogenic miRs were identified. MiRarrays assays demonstrated expression increased after BK stimulation of almost all selected miRs, whereas the LNIO use increased anti-angiogenic levels. Also, based on previous results, two miRs were selected: miR-21 (anti-angiogenic) and miR-126 (pro-angiogenic) for validation. MiR-126 was stimulated by BK at all periods, whereas the use of inhibitors indicated, in general, increased expression levels of miR-21 and maintenance of miR-126 expression levels for up to 2 hours. In conclusion, NO is an important mediator of the angiogenic process stimulated by BK and associated with the EGFR, VEGF, ERK1/2 MAPK and eNOS proteins signaling pathways. Moreover, this mediation can be performeded by modulating pro and anti-angiogenic miRs expression levels.

A angiogênese é um processo que consiste na formação de novos vasos a partir de vasos pré-existentes, e que resulta da ativação das vias de sinalização desencadeadas por VEGF, EGF e seus receptores, e associadas à produção de NO, que então as regula e modula. O objetivo deste trabalho foi identificar miRs possivelmente envolvidos nessas vias relacionadas à angiogênese, e cujo modelo in vitro envolve o estímulo de células endoteliais por BK. Para tanto, foram utilizadas as seguintes metodologias: perfil de expressão e/ou atividade de proteínas por Western blot, ciclo celular por citometria de fluxo, estimativas da concentração de NO por NO Analyzer, formação de capilares em Matrigel (angiogênese in vitro), e expressão de miRs por miRarray e qRT-PCR. Como resultado, o estímulo por BK desencadeou uma via de sinalização constituída pelo EGFR, VEGF, ERK1/2 MAPK e pela eNOS. Estimativas da concentração de NO revelaram uma elevação nos níveis de NO após estímulo com BK, e redução destes ao se adicionar inibidores das proteínas da via acima mencionada. Ao se avaliar os níveis de expressão (VEGF e EGFR) e de fosforilação (ERK1/2 MAPK e eNOS), observou-se que BK promoveu aumento na expressão e/ou atividade destas, enquanto que os inibidores promoveram diminuição nos níveis de expressão de VEGF e EGFR e de fosforilação das ERK1/2 MAPK e eNOS. Análise das fases do ciclo celular revelou que, em células tratadas por BK, o percentual de população na fase G2 era maior após 2h. Já a inibição da eNOS por L-NIO reduziu este percentual, sugerindo que a inibição da eNOS e consequentemente a redução nos níveis intracelulares de NO resultam em parada do ciclo. Ao se avaliar a formação dos capilares a partir de células endoteliais semeadas em Matrigel, verificou-se que a formação destes foi estimulada por BK e inibida quando as células eram pré-incubadas com os inibidores específicos da via. Ao se investigar a participação de miRs como possíveis reguladores do processo, foram identificados 9 miRs pró e 8 miRs anti-angiogênicos in silico. Ensaios de miRarrays demonstraram aumento da expressão de quase todos os miRs após estímulo por BK, enquanto que o uso de L-NIO ampliou os níveis dos anti-angiogênicos. Ainda, com base nos resultados obtidos foram seleciondos dois miRs: miR-21 (anti-angiogênico) e miR-126 (pró-angiogênico) para validação. MiR-126 foi estimulado em todos os períodos de estímulo com BK, enquanto que o emprego dos inibidores indicou, no geral, aumento nos níveis de expressão do miR-21 e manutenção dos níveis de expressão do miR-126 por até 2 horas. Concluiu-se que o NO é um mediador importante do processo angiogênico estimulado por BK e associado à via de sinalização constituída pelas proteínas EGFR, VEGF, ERK1/2 MAPK e eNOS. Mais ainda, esta mediação pode ser exercida através da modulação dos níveis de expressão de miRs pró e anti-angiogênicos.