Metagenômica viral em indivíduos recém diagnosticados pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1)

Abstract

Background: Viral metagenomics has enabled the identification of viruses associated with gastroenteritis, mainly affecting immunosuppressed patients. It is known that people living with HIV/AIDS have impaired immune system and that one of the main sites of persistent viral replication is the lymphatic tissue associated with the intestine, causing an imbalance in its microbiota. Furthermore, the identification of other viruses present in the human microbiota has become important due to its pathogenic potential. Objective: This study aimed to identify viruses in fecal samples from newly diagnosed HIV patients using next-generation sequencing through the technique of viral metagenomics. Methods: 25 samples from newly HIV-infected individuals and 12 from HIV-negative individuals were collected and sent to the Laboratory of Retrovirology at UNIFESP between 2019 and 2021. Study subjects had no signs of diarrhea or symptoms of gastroenteritis. Feces were macerated and DNA/RNA was extracted. cDNA and complementary strand were generated. Libraries were prepared using the Nextera XT protocol and were sequenced on Miseq Desktop. The generated data were analyzed by a pipeline from the University of California and the contigs were submitted to BLASTx and BLASTn for analysis of the similarity with the viral sequences. Results: Of the 37 members of this study, we were able to identify and analyze some members of the human intestinal viroma, where we found viruses related to pathogenesis in humans, such as Astroviridae, Herpesviridae, Retroviridae, Adenoviridae. The bacteriophage families, directly related to the human microbiota and thus to their alterations, where we identified the Microviridae, Podoviridae and Siphviridae. We also identified fragments of giant viruses such as those belonging to the Marseilleviridae, Mimiviridae, Phytoviridae, Phycodnaviridae families that are present in environment, mainly in amoebas. In addition, we also identified some unclassified viruses, where we first identified the complete genome of Pecovirus sp in two newly infected HIV patients. These viral sequences were highly similar (~98%) to those previously identified in Peru. Conclusion: We were able to see that HIV-infected individuals had, in general, a greater number of hits associated with the presence of the virus than those in the control group, which can show us that HIV-infected people are more easily infected. Another important finding is related to the presence of HIV in the feces of individuals who had a low or undetectable viral load. In addition, we identified and characterizedxvii for the first time in Brazil in feces of individuals newly diagnosed with HIV, the pecovirus. Thus, we can conclude that viral metagenomics was effective in identifying viruses belonging to different viral families, however, they did not present complete coding regions for a better analysis, requiring further studies.

Introdução: A metagenômica viral tem possibilitado a identificação de vírus associados à gastroenterite, afetando principalmente os imunossuprimidos. Sabe-se que pessoas que vivem com HIV/aids apresentam comprometimento do sistema imunológico e que um dos principais locais de replicação viral persistente é o tecido linfático associado ao intestino, causando um desequilíbrio em sua microbiota. Além disso, a identificação de outros vírus presentes na microbiota humana, tornou-se importante devido ao seu potencial patogênico. Objetivo: Estudo teve como objetivo identificar vírus em amostras fecais de pacientes com HIV recém-diagnosticados usando o sequenciamento de próxima geração através da técnica de metagenômica viral. Métodos: Um total de 37 indivíduos foram estudados e divididos em dois grupos. 25 amostras de indivíduos recém infectados pelo HIV e 12 de indivíduos HIV negativos foram coletadas e enviadas ao Laboratório de Retrovirologia da UNIFESP entre 2019 e 2021. Os indivíduos do estudo não apresentavam sinais de diarreia ou sintomas de gastroenterite. As fezes foram maceradas e o DNA/RNA foi extraído. O cDNA e a fita complementar foram gerados. As bibliotecas foram preparadas usando o protocolo Nextera XT e foram sequenciadas no Miseq Desktop. Os dados gerados foram analisados por um pipeline da Universidade da Califórnia e os contigs foram submetidos ao BLASTx e BLASTn para análise de a similaridade com as sequências virais. Resultados: O grupo HIV+, 92% eram do gênero masculino, a média de idade foi de 34 anos, a média da contagem de linfócitos T CD4+ foi de 493 células/mm3, média de carga viral de 5.29 log10 cópias/mL e não apresentavam doenças definidoras de aids. No grupo controle, 50% eram do gênero masculino, a média de idade foi de 44 anos. Nenhum dos dois grupos apresentavam diarreia ou quaisquer sintomas relacionados à gastroenterite. A análise de metagenômica identificou famílias virais relacionados à patogenia em humanos como os Astroviridae, Herpesviridae, Retroviridae, Adenoviridae. As famílias de bacteriófagos, relacionados diretamente a microbiota humana, onde identificamos os Microviridae, Podoviridae e Siphoviridae. Também identificamos fragmentos de vírus gigantes como os pertencentes às famílias dos Marseilleviridae, Mimiviridae, Phytoviridae, Phycodnaviridae que estão presentes na natureza, principalmente em amebas. Além disso, identificamos vírus não classificados, o qual identificamos pela primeira vez, o genoma completo do Pecovirus sp em dois pacientes HIV recém infectados noBrasil, sendo elas altamente similares as sequencias do Peru. Conclusão: Os indivíduos infectados com HIV apresentaram de forma geral uma maior quantidade de hits associados a presença de vírus do que os do grupo controle, o que pode nos evidenciar que as pessoas infectadas com HIV apresentam uma maior propensão a infecções. A presença do HIV nas fezes dos indivíduos que apresentavam carga viral baixa ou indetectável também foi muito importante. Além disso, identificamos e caracterizamos pela primeira vez no Brasil o pecovirus em indivíduos recémdiagnosticados com HIV. Sendo assim a metagenômica viral foi eficaz na identificação de vírus pertencentes a diferentes famílias virais, porém não conseguimos estabelecer uma correlação entre as contagens de T CD4+ e carga viral.