dissertação
Análise genômica da proteína P1 de isolados brasileiros e cubano do Papaia ringspot virus (PRSV) e interação vírus-planta utilizando como modelo o Soybean yellow shoot virus (SoyYSV)
Genomics analysis of P1 protein from brazilian and cuban isolates of Papaya ringspot virus (PRSV) and virus-plant interaction using as model Soybean yellow shoot virus (SoyYSV)
Registro en:
RESENDE, F. M. P. de. Análise genômica da proteína P1 de isolados brasileiros e cubano do Papaia ringspot virus (PRSV) e interação vírus-planta utilizando como modelo o Soybean yellow shoot virus (SoyYSV). 2019. 58 p. Dissertação (Mestrado em Fitopatologia)–Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2019.
Autor
Resende, Franciely Maria Pereira de
Institución
Resumen
Papaya ringspot virus (PRSV) is one of the main viruses affecting papaya crops in Brazil and
in other countries where this plant is grown. There are two naturally occurring strains in the
field: PRSV-P that infects papaya and cucurbits and PRSV-W that infects cucurbits only. Their
control is hindered by the fact that viruses have no curative control, papaya is a semi-perennial
plant and the virus is easily spread in the fields by the Myzus persicae vector. In Brazil the virus
has been controlled by roguing, which does not always present the expected results. In other
countries PRSV has been satisfactorily controlled through the use of transgenic plants
transformed with viral CP. However, there is some evidence that some regional PRSV isolates
are capable of breaking the resistance of the transgenic plant, indicating that these plants should
be transformed with genes from the isolates to which it will be exposed. Therefore, the isolates
must be sequenced and analyzed, to provide support to breeding programs aiming to obtain
pathogen resistance plant. In this work the P1 protein genes from five isolates from Brazil and
one from Cuba were sequenced and analyzed in order to know their genetic identity. The genes
were amplified using specific primer pairs and sent for sequencing at GENEWIZ, and analyzed
using the NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information - NCBI, 2015),
CLUSTAL W2 program. Phylogenetic trees were constructed using the MEGA 7.0 (Molecular
Evolutionary Genetics Analysis) program. The identity between the Brazilian isolates and
between them and the Cuban isolate was 87% or greater, and when compared with GenBank
isolates the highest identity was observed with protein P1 of strain PRSV-W. On the other hand,
PRSV-P isolates available from GenBank had a higher identity with isolates of PRSV-P strain.
This shows that the Brazilian isolates analyzed have a peculiar characteristic, which
differentiates them from most isolates already described in other parts of the world. In a second
experiment, proteins from a member of the Potyviridae family, Soybean yellow shoot virus
(SOyYSV) which was recently sequenced in Brazil, was chosen as a model to study virus-plant
interaction because it is the only virus in this family that causes local lesion in papaya. Four
genes of this virus were amplified and cloned by the Gateway system to be expressed via
Agrobacterium tumefaciens in papaya plants: CP, HcPro, P1 and VPg. Twenty days after
agroinfiltration the leaves of the plants were analyzed by RT-PCR and by observation under
Epifluorescence microscope. None of the proteins induced local lesion in the agroinfiltrated
leaves and all of them translocated and were detected in the leaves that expanded after
agroinfiltration. This indicates that either the plant's HR reaction is elicited by other viral
proteins or they act in combination to be recognized by the host plant. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) O Papaya ringspot virus (PRSV) é um dos principais vírus que afetam as lavouras de mamão
no Brasil e em outros países onde essa planta é cultivada. Existem duas estirpes que ocorrem
naturalmente no campo: a PRSV-P que infecta mamão e cucurbitáceas e a PRSV-W que infecta
apenas cucurbitáceas. O seu controle é dificultado pelo fato de que os vírus não possuem
controle curativo, o mamoeiro é uma planta semi-perene e o vírus é facilmente disseminado nos
campos pelo vetor Myzus persicae. No Brasil o vírus tem sido controlado por meio de roguing,
que nem sempre apresenta os resultados esperados. Em outros países como Austrália e Índia, o
PRSV tem sido satisfatoriamente controlado por meio do uso de plantas transgênicas,
transformadas com a CP viral. Entretanto, existem algumas evidênciasque alguns isolados
regionais de PRSV são capazes de quebrar a resistência da planta transgênica, indicando que
essas plantas devem ser transformadas com genes dos isolados aos quais ela será exposta. Para
isso, os isolados devem ser sequenciados e analisados, para oferecer subsídios aos programas
de melhoramento visando conferir resistência à planta. Nesse trabalho os genes da proteína P1
de cinco isolados do Brasil e um de Cuba foram sequenciados e analisados com a finalidade de
conhecer a sua identidade genética. Os genes foram amplificados empregando os pares de
primers específicos e enviados para sequenciamento na GENEWIZ, e analisados utilizando-se
o programa NCBI BLAST (NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY
INFORMATION - NCBI, 2015), CLUSTAL W2 (V. 2.0). As árvores filogenéticas foram
construídas utilizando-se o programa MEGA 7.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis).
Observou-se que a identidade entre os isolados brasileiros e entre esses e o isolado de Cuba foi
igual ou maior a 87% e que, quando comparados com os isolados do GenBank a maior
identidade foi observada com a proteína P1 da estirpe PRSV-W. Por outro lado, os isolados do
PRSV-P disponíveis no GenBank apresentaram uma maior identidade com isolados dessa
estirpe. Isso demonstra que os isolados brasileiros analisados possuem uma característica
peculiar, que os diferencia da maioria dos isolados já descritos em outras partes do mundo. Em
relação ao segundo experimento, proteínas de um membro da família Potyviridae, o Soybean
yellow shoot vírus (SOyYSV) recentemente sequenciado e analisado no Brasil, foi escolhido
como modelo par estudar a interação vírus-planta devido ao fato de ser o único vírus dessa
família que causa lesão local em mamoeiro. Quatro genes desse vírus foram amplificados e
clonados no sistema Gateway para serem expressos via Agrobacterium tumefaciens em plantas
de mamão: CP, HcPro, P1 e VPg. Vinte dias após a agroinfiltração as folhas das plantas foram
analisados por RT-PCR e por observação em microscópio de Epifluorescência. Nenhuma das
proteínas induziu lesão local nas folhas agroinfiltradas e todas elas se translocaram e foram
detectadas nas folha que se expandiram após a agroinfiltração. Isso indica que ou a reação de
HR da planta é elicitada ou outras proteínas virais ou elas atuam em combinação para serem
reconhecidas pela planta hospedeira.
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