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MicroRNAs that regulate the expression of the transcription factors SNAIL, SLUG, ZEB1 and TWIST repress the invasion, migration and cell proliferation in breast cancer
MicroRNAs que regulan la expresión de SNAIL, SLUG, ZEB1 y TWIST reprimen la invasión, migración y proliferación celular en cáncer de mama
Autor
Pérez Moreno, Elisa Valentina
Institución
Resumen
Breast cancer is classified in different tumor subtypes, each one with different molecular and clinical traits, specially in relation to the development of metastasis and overall survival. On the other hand, metastasis is the leading cause of death in cancer, being one of the topics with more interest in cancer research. One of the first signs of metastasis in breast cancer is the presence of tumors in the lymph nodes close to the tumor, whose detection is important because it determines the treatment to which the patient will be subjected. At the molecular level, metastasis begins with a phenotypic change of the cells, called epithelial-mesenchymal transition, which is induced by the transcription factors SNAIL, SLUG, ZEB1 and TWIST. Because these changes in cells must be plastic and reversible, epigenetic alterations have been involved in epithelial-mesenchymal transition. MicroRNAs can regulate large sets of genes involved in cancer development and metastasis, and have emerged as molecular markers and potential therapeutic targets. In this thesis, we proposed to identify microRNAs which expression is altered in breast cancer, and that participate in metastasis development through the regulation of SNAIL, SLUG, ZEB1 and TWIST. For this purpose, we performed immunohistochemistry in 101 breast tumors to detect the expression of these four transcription factors. This information was combined with data from microRNA microarrays previously performed in this group of tumors. Thus, we identified 94 microRNAs down- regulated in tumors with SNAIL, SLUG, ZEB1 and TWIST expression. Through in silico analysis we found that 33 of these microRNAs are predicted as regulators of these transcription factors expression, and six were selected for their validation: miR-196a, miR- 202, miR-21, miR-22, miR-331 and miR-34b. Through luciferase reporter gene assays, it was confirmed the regulation of these microRNAs over there in silico predicted targets, except for miR-34b who did not show an effect. In addition, these microRNAs are able to decrease migration, invasion and/or proliferation of MDA-MB-231 cell line, proving to be anti-metastatic microRNAs. Two of the analyzed microRNAs, miR-196a and miR-22, decreased endogenous ZEB1 levels in the used cell line model, confirming for the first time this transcription factor as a new regulation target of these two microRNAs in cancer. Additionally, we demonstrated through different approaches that miR-196a, miR-202 and miR-30a regulate CCR7 levels, a chemokine receptor involved in targeted cell migration to lymph nodes. Our results suggest that loss of expression of microRNAs miR-196a, miR-202, miR-210, miR-22, miR-331 and miR-34b in breast cancer contributes to lymph node metastasis formation through an increase of metastatic traits of tumor cells and/or their targeted migration toward the lymph nodes near to the tumor. El cáncer de mama se clasifica en distintos subtipos tumorales, cada uno de los cuales presenta diferentes características moleculares y clínicas, en especial en relación a la aparición de una metástasis y la sobrevida general. Por su parte, la metástasis corresponde a la primera causa de muerte por cáncer, siendo uno de los temas de mayor interés hoy para la investigación en cáncer. Una de las primeras evidencias de metástasis en cáncer de mama es la presencia de tumores en los nodos linfáticos cercanos al tumor, cuya detección es importante, ya que determina el tratamiento al cual será sometida la paciente. A nivel molecular, la metástasis inicia con un cambio fenotípico de las células, denominado transición epitelio-mesénquima, el cual es inducido por los factores de transcripción SNAIL, SLUG, ZEB1 y TWIST. Debido a que estos cambios en la célula deben ser plásticos y reversibles, las alteraciones epigenéticas se han visto involucradas en la transición epitelio- mesénquima. Los microRNAs tienen la habilidad de regular varios genes involucrados en el desarrollo del cáncer y en la metástasis, por lo tanto, han surgido como marcadores moleculares y posibles blancos de terapia. En esta tesis se propuso identificar microRNAs, cuya expresión se encuentra alterada en cáncer de mama, y que participan en el desarrollo de la metástasis a través de la regulación de SNAIL, SLUG, ZEB1 y TWIST. Para este propósito, se realizó inmunohistoquímica en 101 tumores de mama con el fin de determinar la expresión de estos cuatro factores de transcripción. Esta información fue combinada con datos de microarreglos de expresión de microRNAs previamente realizados en este grupo de tumores. De esta forma, se identificaron 94 microRNAs que se encuentran sub-expresados en tumores con expresión de SNAIL, SLUG, ZEB1 y TWIST. Mediante análisis in silico se encontró que 33 de estos microRNAs se encuentran predichos como reguladores de la expresión de estos factores de transcripción, y seis fueron seleccionados para su validación: miR-196a, miR-202, miR-210, miR-22, miR-331 y miR-34b. Mediante ensayos de gen reportero luciferasa se confirmó la regulación de estos microRNAs sobre los blancos predichos in silico, excepto para miR-34b que no mostró efecto. Además, estos microRNAs son capaces de disminuir la migración, la invasión y/o la proliferación de la línea celular MDA-MB-231, demostrando ser microRNAs anti-metastásicos. Dos de los microRNAs analizados, miR-196a y miR-22, disminuyen los niveles endógenos de ZEB1 en el modelo celular utilizado, confirmando por primera vez a este factor de transcripción como un blanco de regulación de estos dos microRNAs en cáncer. Adicionalmente, demostramos mediante distintas aproximaciones que miR-196a, miR-202 y miR-30a regulan los niveles de CCR7, receptor de quimioquinas involucrado en la migración específica de las células hacia los nodos linfáticos. Nuestros resultados sugieren que la pérdida de expresión de los microRNAs miR-196a, miR-202, miR-210, miR-22, miR-331 y miR-34b en cáncer de mama contribuye a la formación de metástasis en los linfonodos, mediante el aumento de las características metastásicas de las células tumorales y/o de su migración dirigida hacia los nodos linfáticos cercanos al tumor. Paper en revisión, aún no publicado