En el corazón, el estado contráctil (inotrópico) refleja principalmente la disponibilidad de calcio en el citoplasma y la sensibilidad de la maquinaria contráctil por este ión. El estado inotrópico se puede modificar a su vez por cambios en la frecuencia cardíaca y por acción de las catecolaminas (adrenalina, noradrenalina), que actúan a través de los receptores 0 adrenérgicos. El óxido nítrico (NO) es un importante mensajero intracelular, generado a partir del aminoácido L-arginina, por una familia de enzimas denominadas óxido nítrico sintasas (NOS). En las células del miocardio se expresan dos isoformas de esta enzima: eNOS y nNOS. La eNOS se encuentra localizada en caveolas del sarcolema y la nNOS, en el retículo sarcopl asmático. El NO activa la guanilato ciclasa, con la consecuente formación de GMP cíclico (GMPc). Este mensajero intracelular es capaz de activar a la proteína kinasa G (PKG). En el cardiomiocito, PKG puede fosforilar a la troponina 1, lo que disminuye la sensibilidad de los miofilamentos al Ca2 , y también al canal de calcio tipo L, cuya fosforilación disminuye la entrada de Ca2 . Como consecuencia, estas fosforilaciones disminuyen el inotropismo. Por otra parte, el NO puede producir efectos independientes de GMPc. Se ha descrito que el receptor de nanodina (RyR2) puede ser modificado por efecto directo del NO, a través de S-nitrosilación en residuos de cisteínas de esta proteína, lo que aumenta su probabilidad de apertura y la liberación de Ca2. Basado en estos antecedentes, la hipótesis de trabajo de esta tesis es que la activación de la nNOS favorece la contractilidad cardiaca a través de S-nitrosilación de proteínas que participan en el acoplamiento excitación-contracción, especialmente RyR2. Por otro lado, la activación de la eNOS produce activación de la vía del GMPc-PKG, lo que disminuye la entrada de Ca 2+ por los canales tipo L y la sensibilidad de los miofilarnentos al Ca2; proponemos que una vez activada la guanilato ciclasa, la vía de GMPc-PKG, predomina por sobre el mecanismo de S-nitrosilación (o reacciones redox asociadas). El objetivo general de esta tesis fue estudiar el papel de las isoformas eNOS y nNOS en la respuesta contráctil inducida por isoproterenol y el papel que el NO generado cumple en la función contráctil, ya sea a través de movilización de GMPc o de mecanismos de nitrosilaciónlredox de proteínas específicas. Para esto se usó la preparación de corazón aislado (Langendorff) de rata y cardiomiocitos aislados de ratón. En estos modelos estudiamos la contractilidad midiendo los cambios en velocidad de contracción (dP/dt max ), el grado de acortamiento del sarcómero y/o los cambios en el Ca 2 citosólico. La participación de las isoformas de NOS y las vías de transducción se señales se estimó usando un inhibidor específico de nNOS (SMTC) e inhibidores para ambas isoformas (L-NAME y L-NMMA) más el efecto de SNAP, un donante de NO, bloqueadores de guanilato ciclasa y PKG, o mediante el uso de ratones deficientes en nNOS, eNOS, o GSNO-R. Efecto de NO exógeno en la contractilidad cardiaca. al perfundir el corazón con SNAP a concentraciones iO-iO M la contractilidad cardiaca aumentó ( 25%), sin que aumentaran los niveles tisulares de GMPc. Este El efecto inotrópico positivo de SNAP se previno al tratar los corazones con TEMPOL, un agente símil de la superóxido dismutasa. Además SNAP 10_6 M indujo la S-nitrosilación del receptor de rianodina. Al contrario, la aplicación de SNAP a concentración lO M disminuyó la contractilidad (- 25%), en paralelo con un aumento en los niveles de GMPc tisular. Este efecto se previno por el bloqueo farmacológico de la guanilato ciclasa y de la PKG, pero no por TEMPOL.PFCHA-BecasDoctor en Ciencias Biológicas Mención Ciencias Fisiológicas131 p.PFCHA-BecasTERMINADA