Tesis Doctorado
Nucleótidos extracelulares promueven la proliferación de células epiteliales por trans-regulación de la actividad y expresión del receptor de egf
Autor
Buvinic-Radic, Sonja Milena
Institución
Resumen
Los receptores P2Y (RP2Y) pertenecen a la familia de receptores acoplados a proteína
G (GPCR) y se activan por nucleótidos extracelulares. Su función en la regulación de diversos
procesos fisiológicos de corto plazo, tales como el transporte jónico en epitelio, el control del
tono vascular o la agregación plaquetaria, ha sido claramente establecida. Sin embargo,
algunas evidencias sugieren que los nucleótidos extracelulares podrían participar también en la
regulación de la proliferación celular, que involucra cambios en la expresión génica. Debido a
que ATP y UTP se liberan profusamente al medio extracelular luego de una lesión, distensión
de tejidos o procesos inflamatorios, postulamos que los nucleótidos y sus receptores más
ubicuos constituyen un sistema general de regulación de la proliferación celular, importante en
la mantención y reparación de tejidos. En esta Tesis nos plantemos la hipótesis que el RP2Y1,
el subtipo de RP2Y más ampliamente distribuido en el organismo, regula la actividad
mitogénica del receptor del factor de crecimiento epidermal (REGF), que es uno de los
sistemas más ubicuos de control de la proliferación celular. El REGF no sólo se activa por sus
propios ligandos sino también por agonistas de numerosos GPCRs (transmodulación). Como
el REGF cumple una función importante en epitelios y en cánceres derivados de estos tejidos,
decidimos analizar esta hipótesis tanto en células epiteliales normales (FRT y MDCK) como
en células tumorales derivadas de epitelio (HeLa).
Inicialmente generamos un anticuerpo específico contra el RP2Y 1 que mostró en
inmunoblot la expresión endógena de este receptor en células FRT y HeLa, pero no en células
MDCK. La ausencia del RP2Y 1 en MDCK se corroboró en estudios funcionales midiendo
aumentos de calcio en respuesta a sus agonistas. Todas estas células expresan, sin embargo, el REGF, dando la posibilidad de comparar las relaciones funcionales del REGF con el RP2Y1
endógeno y el expresado ectópicamente por transfección.
Demostramos que la activación del RP2Y 1 endógeno promueve la proliferación de
células FRT y HeLa por un mecanismo que involucra transactivación del REGF. El agonista
selectivo para el RP2Y1 , 2-MeSADP, estimuló la incorporación de [ 3H]-Timidina en células
FRT y HeLa en forma concentración-dependiente, con valores de CE50 de 42±7 nM y 76±3
nM, respectivamente. ADP, el agonista natural del receptor, remedó este efecto con valores de
CE50 de 26±5 nM en células FRT y 49±4 nM en células HeLa. El antagonista selectivo del
RP2Y 1 , MRS2 179, bloqueó totalmente estos efectos. Detectamos niveles basales de ATP y de
sus metabolitos ADP y adenosina en el medio extracelular y determinamos la vida media de
estos nucleótidos liberados luego de daño celular. El ADP mostró una vida media de
aproximadamente 70 min en células FRT y 90 min en células HeLa. La aplicación de 2-
MeSADP por 10-15 min fue suficiente para aumentar la incorporación de [ 3H]-Timidina y
promover la síntesis de ciclinas-D en células FRT y HeLa. Tanto la degradación de los
nucleótidos extracelulares con apirasa como el antagonista selectivo MRS2179 disminuyeron
en un 15-25% la incorporación basal de [ 3HJ-Timidina en ambos tipos celulares. Estos
resultados indican que la liberación endógena de nucleótidos regula la tasa de proliferación
basa] y que un tiempo de activación del RP2Y 1 concordante con la vida media de los
nucleótidos extracelulares es suficiente para inducir el efecto mitogénico. En contraste con los
mitógenos descritos hasta la fecha, que requieren entre 7 y 9 horas de exposición para
desencadenar proliferación, los nucleótidos son efectivos en pocos minutos.
El 2-MeSADP aumentó la fosforilación en tirosina del REGF, 3-4 veces en células
FRT y aproximadamente 20 veces en células HeLa, y la fosforilación de las proteínas ERKI/2.Bloqueadores de la actividad tirosina-quinasa del REGF (AG1478), de PKC (Ro3 18220), de
src (PP2), de metaloproteasas (ilomastat) o de receptores de IP3 que promueven la salida de
calcio del retículo endoplásmico (2-APB) disminuyeron entre un 40 y un 100% la
incorporación de [ 3 H]-Timidina inducida por 2-MeSADP 1 1.tM. Por lo tanto, la estimulación
del RP2Y 1 lleva a transactivación del REGF por mecanismos similares a los descritos para
otros GPCRs.
Inesperadamente, observamos que la expresión ectópica del RP2Y 1 por transfección
estable de células MDCK generó un fenotipo altamente proliferativo y dependiente del REGF.
El RP2Y 1 ectópico disminuyó el tiempo de duplicación de 21,8 ± 0,9 h a 13,4 ± 0,4 h y
aumentó al doble la incorporación basa¡ de [ 3H]-Timidina respecto de las células nativas,
siendo este efecto bloqueado por el inhibidor AG 1478. Además, en las células MDCK/RP2Y1
detectamos un aumento de 3,3 ± 0,6 veces en la masa total del REGF y de 2,2 ± 0,1 veces en
la biosíntesis del REGF, respecto de las células MDCK nativas. Esta expresión aumentada del
REGF fue dependiente de la actividad de PKC y del propio REGF.
Debido a que tanto los nucleótidos extracelulares como el RP2Y 1 son muy ubicuos,
podrían considerarse como un sistema trófico generalizado y sensor en primera línea de los
requerimientos proliferativos de las células en condiciones normales o patológicas. La relación
funcional entre el RP2Y 1 y el REGF convierte a los nucleótidos en un blanco terapéutico de
interés, debido al papel fundamental que tiene el REGF en procesos de tumorigénesis,
desarrollo o reparación de tejidos. PFCHA-Becas Doctor en Ciencias Biológicas Mención en Biología Celular y Molecular 206p. PFCHA-Becas TERMINADA