Tesis Doctorado
Determinación del mecanismo de la modulación alosterica positiva de zinc en el receptor P2X4
Autor
Peralta Peralta, Francisco Andrés
Institución
Resumen
El ATP es un neurotransmisor que activa receptores metabotrópicos y ionotrópicos; de estos, los receptores P2X (P2XR 1-7) son canales catiónicos no selectivos. El P2X4R se expresa en el sistema nervioso central y participa en procesos neurofisiológicos y neuropatológicos como el dolor crónico. Este es modulado alostéricamente por Zn(II) a concentraciones fisiológicamente relevantes. Zn(II) es un metal con funciones estructurales y catalíticas en proteínas. Además, este metal es un modulador de la actividad de diversos canales iónicos, pero se desconoce el mecanismo de modulación en el P2X4R. Esta tesis se avocó en precisar el mecanismo molecular por el cual Zn(II) modula positivamente al P2X4R. Se propone que en presencia de Zn(II) se reduce un puente disulfuro extracelular del receptor y posteriormente el metal se coordina con tioles libres y residuos ácidos del entorno. Para poner a prueba esta hipótesis, se combinó técnicas bioinformáticas con registros electrofisiológicos de receptores nativos y mutados puntualmente. Se calculó el potencial electrostático de los modelos del receptor y se realizaron simulaciones de dinámica molecular del receptor en presencia de Zn(II). Se expresó heterólogamente el rP2X4R, y sus mutantes en oocitos de Xenopus laevis y se registraron corrientes evocadas por ATP mediante fijación de voltaje con dos electrodos. Para determinar tioles libres se usaron alquilantes de sulfhidrilos. El análisis in-silico del potencial electrostático muestra un potencial favorable para la interacción de Zn(II) con el SS2 y el SS3. Este potencial se modifica en las mutantes E118A, E118Q, E160A, E160Q, D170A y D170Q. Se comparó la diferencia de EC50 del receptor WT v/s sus mutantes. Zn(II) desplaza la EC50 del rP2X4R WT 3,8 veces, lo que no ocurrió en las mutantes E160Q y D170N, Indicando que E160 y D170 son críticos para la modulación alostérica. E118Q redujo 21,9 veces la EC50 para ATP pero aún así es modulada por Zn(II). Por otro lado, las EC50 de las mutantes del SS2 (C126A/C149A) y del SS3 (C132A/C159A, C132S/C159S y C132T/C159T) disminuye en presencia de Zn(II), sin embargo, las mutantes de C132A y C149A no son moduladas por Zn(II). Al tratar oocitos que expresan el rP2X4R con NEM en presencia de Zn(II) se pierde la modulación alostérica del metal, lo que no ocurre en ausencia del metal. Al tratarlos con NEM en presencia de DTT se anula la potenciación de Zn(II). Esta pérdida de modulación alostérica es dependiente del SS3. En conclusión, se propone que la modulación alostérica de Zn(II) depende de la reducción del SS3 (que a su vez depende del potencial electrostático) y que los ligandos para el metal son C132 y C149. PFCHA-Becas PFCHA-Becas