Tesis Doctorado
Estudio de la relación entre los perfiles de expresión génica durante el desarrollo embriónarió de especies del género drosophila y la conservación de las regiónes reguladoras de los genes involucrados
Autor
Hodar-Quiroga, Christian Eduardo
Institución
Resumen
La información heredada y codificada en el DNA, el genotipo, es la que a través de interacciones con el ambiente y con los mecanismos internos de regulaciónespacio-temporal de la expresión génica permite constituir el fenotipo. Así, la regulación transcripcional se torna en un elemento de enorme relevancia para definir la interacción dinámica que se establece entre genotipo y fenotipo En un contexto evolutivo, es factible preguntarse si la expresión génica, considerada como un carácter del fenotipo, esta limitada en su variación por restricciones filogenéticas que operan durante la historia de un grupo de especies. En esta tesis se propuso estudiar si los perfiles de expresión que exhiben un conjunto de genes durante la embriogénesis de tres especies de Drosophila poseen señal filogenética, es decir, que especies más cercanas muestran mayor similitud en sus perfiles de expresión génica que aquellas más lejanas, y si el grado de similitud entre los perfiles de expresión se correlacionaba con el tipo o número de módulos de regulación en cis de los genes que los originan.Los objetivos específicos fueron: 1) Identificar en D. pseudoobscura (Dp)y D.virilis (Dv) genes ortólogos a los que componen una genoteca de sustracción de D.melanogaster (Dm); 2) Construir microarreglos con cDNA de Dm e hibridarlos con poblaciones de cDNA de las tres especies, obtenidos en cuatro diferentes estados del desarrollo, 3) Obtener datos de expresión y determinar los transcritos que cambiansignificativamente su nivel de abundancia para cada una de las especies; 4) Evaluar la variación de los perfiles de expresión en función de la señal filogenética del grupo estudiado; 5) Identificar módulos de regulación en cis y evaluar su similitud entre especies, 6) Evaluar la actividad transcripcional dirigida por regiones reguladoras del gen CG6234 en Dm durante el desarrollo embrionario temprano y 7) evaluar la funciónde CG6234 durante el desarrollo embrionario de Dm.El análisis de los datos de microarreglos, permitió obtener un grupo de 121 genes activados diferencialmente en estados tempranos del desarrollo en las tres especies estudiadas. Para algunos de ellos, se efectuaron verificaciones de su perfil de expresión, mediante hibridaciones in situ y PCRs cuantitativos. El análisis de restricciónfilogenética determinó que, en conjunto, los perfiles de expresión de estos genespresenta señal filogenética en cada estado analizado, indicando que las variaciones globales de expresión reflejan la historia evolutiva del grupo estudiado. El análisis individual de los perfiles de expresión reveló que algunos de ellos no presentan señal filogenética en uno o más de los estados estudiados, sugiriendo que distintos mecanismos de evolución operan sobre la expresión temporal de genes particulares.En el caso del gen CG6234, la ausencia de señal filogenética se hizo evidente alobservar que su patrón de expresión temporal y espacial era más similar entreespecies lejanas, Dm y Dv, que entre especies cercanamente emparentadas, Dm y Dp, y se propuso que esta diferencia podría atribuirse a cambios en los módulos de regulación en cis de este gen. Los análisis in silico de las regiones no codificantes río arriba del inicio de transcripción del gen permitieron identificar una región conservada en las tres especies que contiene potenciales sitios para la unión de los factores detranscripción Mad y Zen y revelaron que existía una inserción de 4 posibles sitios unión para Mad en la región no codificante de DpCG6234. Para evaluar la funcionalidad de esta región reguladora se generaron líneas transgénicas de Dm portadoras del gen reportero lacZ fusionado a las secuencias de regulación en cis de DmCG6234. Estos ensayos demostraron que una secuencia de 524 pb, que contenía los potenciales sitiosde unión para Mad y Zen, era capaz de dirigir la expresión espacio-temporal del gen reportero y recuperar el patrón endógeno de expresión de CG6234. Además, utilizando ensayos de EMSA se comprobó que Mad se une de manera específica a los sitios identificados tanto en DmCG6234 como en DpCG6234. Más aún, Mad se unía con mayor afinidad a un oligonucleotido que contiene los cuatro sitios adicionales de unión identificados en OpCG6234, sugiriendo que esta inserción, podría cambiar la afinidad de la región de 524 pb por Mad y en consecuencia el patrón de expresión de CG6234.Finalmente, se realizó un primer análisis de la función de este gen en Dm, medianteinhibición de su expresión usando dsRNAs y ganancia de función utilizando el sistema GAL4/UAS. Los resultados obtenidos indican que cambios en la expresión de DmCG6234, alteran la organización de la amnioserosa, lo que trae como consecuencia defectos en la retracción de la banda germinal y pérdida de estructuras dorsales.En conclusión, los cambios de expresión génica son una representacióncuantitativa de un carácter fenotípico susceptible de variar. Los resultados expuestos indican que, entre especies, variaciones en la expresión de genes en estados tempranos del desarrollo pueden ser generadas a través de cambios en sus regiones reguladoras. Es posible proponer que las restricciones a estas variaciones fenotípicas dependen de la jerarquía de funciones y/o interacciones que posee un gen. El gen CG6234 ejemplifica este punto, puesto que su expresión varía entre especies en estados tempranos del desarrollo, sin embargo durante la diferenciacion y mantención de la amnioserosa cuando su función es necesaria, su expresión se restrige a esta membrana extraembrionaria. Más aún, se propone que la respuesta de CG6234 algradiente de Dpp y a su factor de transcripción Mad es el mecanismo que regula la expresión espacio-temporal de este gen. PFCHA-Becas Doctor en Bioquímica 215p. PFCHA-Becas TERMINADA