Tesis Doctorado
Estudio de la respuesta transcripcional por exposición a cobre de L. monocytogenes cultivada en frío
Study of the transcriptional response to exposure to copper of L. monocytogenes growing at low temperature
Autor
Quesille-Villalobos, Ana María
Institución
Resumen
A la fecha, se desconoce cómo Listeria monocytogenesresponde transcripcionalmente al cobre cuando es cultivada a bajas temperaturas. La identificación de esta respuesta podría ser de ayuda para comprender cómo L. monocytogenes es capaz de adaptarse a los ambientes hostiles. Esta investigación tuvo como propósito comprender la respuesta fenotípica y transcripcional del patógeno alimentario L. monocytogenes a la combinación de los factores de estrés, frío y cobre.
En el presente estudio, se determinó la tolerancia (n=15) y la cinética de proliferación (n=6) de aislados de L. monocytogenes cultivados a baja temperatura (8ºC) con diferentes concentraciones de cobre. Los resultados indicaron que todos los aislados de L. monocytogenes presentaron los mismos niveles de tolerancia al cobre. Sin embargo, se observó que los aislados poseen diferentes rendimientos en la proliferación cuando son sometidos a concentraciones sub-inhibitorias de cobre en frío. Las principales diferencias se observaron en la DO600nm máxima alcanzada y en la velocidad de proliferación entre los aislados.
Se seleccionó el aislado List2-2 que presentó mayor rendimiento a cobre en frío para estudiar la respuesta transcripcional global de la bacteria cultivada en frío y expuesta a un estrés agudo de cobre (0.5mM). Se observó que 9,2% y 2,6% de los genes cambiaron significativamente su abundancia relativa a 8ºC y 37ºC, respectivamente. A 8ºC solo diez genes presentaron un cambio positivo y a 37oC nueve genes presentaron un cambio positivo. Los resultados sugieren que la disminución en la abundancia de los transcritos, interpretados como represión de genes, es el fenómeno que domina en la bacteria bajo las condiciones experimentales ensayadas. Probablemente, esto responda a una redirección de los recursos energéticos de la bacteria en pos de activar solo los mecanismos diana al estrés presente. Además, los resultados evidenciaron que L. monocytogenes responde a la combinación de frío y cobre como un estrés distinto, y no como a la sumatoria de ambos estímulos.
Posteriormente, en otros dos aislados de L. monocytogenes, se cuantificó la expresión relativa de un grupo de 17 genes que mostraron cambios estadísticamente significativos en el análisis de expresión global para evaluar la conservación en la respuesta transcripcional de la bacteria. Se evidenció que tan solo 6 de 17 genes evaluados presentaron cambios significativos en la abundancia de los transcritos y conservaron la dirección del cambio. Las diferencias a nivel de regulación transcripcional podrían ayudar a dar respuesta a las variaciones observadas a nivel fenotípico entre los aislados de L. monocytogenes.
Los resultados obtenidos en la presente investigación permiten sugerir que el uso de cobre podría ser efectivo para el control de este patógeno alimentario en la industria. Cabe destacar, que la presente investigación es la primera en evaluar las bases genéticas de la respuesta del patógeno alimentario L. monocytogenes frente al estrés combinado por frío y cobre, lo que contribuye a la comprensión de los mecanismos moleculares empleados por bacterias para enfrentar más de un estrés simultáneamente. Currently, the transcriptional response of Listeria monocytogenes growing at low temperatures under the effect of copper is unknown. Understanding this response may help in the comprehension of how L. monocytogenes is capable of adapting to hostile environments. The main objective of this study was to understand the phenotypic and transcriptional response of L. monocytogenes to the combination of two stress factors: low temperature and copper.
In this study, the tolerance (n = 15 isolates) and proliferation kinetics (n = 6 isolates) of L. monocytogenes cultivated at low temperature (8 ºC) with different copper concentrations were determined. Results showed that all the L. monocytogenes isolates had the same degree of tolerance to copper. However, differences were observed in terms of their proliferation fitness at 8 ºC when exposed to sub-inhibitory copper concentrations. These differences relate to the maximum OD600nm reached and the growth rate of the strains.
To study the global transcriptional response of L. monocytogenes growing at low temperature, exposed to acute copper stress (0.5 mM), we selected the List2-2 isolate because it showed the highest yield in the experimental conditions aforementioned. A total of 9.2 % and 2.6 % of the entire set of genes changed their relative abundance at 8 ºC and 37 ºC, respectively. At 8 ºC, ten genes exhibited an increment in their relative abundance while at 37 ºC, nine genes had the same response. These results suggest that the decrease in the abundance of the transcripts, interpreted as a down-regulation, is the dominant phenomenon in this bacterium when exposed to the experimental conditions tested. It is probable that there is a reorganization of the metabolic energetic resources in List2-2 to activate the core response mechanisms to this stress. Additionally, the results suggested that L. monocytogenes responds to the combined exposure of low temperature and copper as a new stress condition, and not as the sum of each stress separately.
In order to evaluate the conservation of the transcriptional response, two L. monocytogenes isolates were studied. We quantified the relative expression of 17 genes selected from the global expression analysis. Six out of seventeen genes evaluated showed significant changes in their relative abundance, and also kept the direction of change. The differences observed at a transcriptional level could be a response to the variability observed at the phenotypic level between L. monocytogenes isolates.
Results obtained in this research suggest that the use of copper could be effective for the control of this foodborne pathogen in the industry. This is the first research that evaluates the genetic bases of the transcriptional response of the foodborne pathogen L. monocytogenes to the combination of low temperature and copper stress. This information contributes to the understanding of the molecular mechanisms used by bacteria to deal with a combination of stresses. PFCHA-Becas PFCHA-Becas