La bacteria Pseudomonas veronii R4 aislada desde la rizósfera de vid, presenta alta actividad nematicida sobre Xiphinema index. Este nemátodo es el vector del virus de la hoja de abanico de la vid, el agente viral más importante que afecta este cultivo. P. veronii R4 está relacionado filogenéticamente con cepas de P. fluorescens promotoras del crecimiento de plantas. Las cuales secretan una batería de enzimas extracelulares que podrían estar participando en su actividad biocontroladora. En esta tesis, se postuló que la cepa R4 ejerce su actividad nematicida sobre X. index mediante la secreción de enzimas hidrolíticas. Se propusieron como objetivos específicos: (i) identificar los genes del genoma de P. veronii R4 que podrían estar participando en su actividad nematicida, (ii) evaluar los genes que son diferencialmente expresados en esta cepa por la interacción con X. index (iii) evaluar el rol nematicida sobre X. index de las enzimas extracelulares codificadas por los genes candidatos de P. veronii R4. Mediante el análisis del genoma secuenciado de P. veronii R4 se determinaron los genes que codifican enzimas extracelulares junto con sistemas de secreción que podrían participar en la exportación de estas enzimas. La secuenciación y análisis del transcriptoma de P. veronii R4 expuesta a extracto de X. index indicó que esta cepa es capaz de sensar las proteínas y azucares del nemátodo como fuente de C y N, induciendo los genes relacionados con su transporte. Se observó la inducción del gen que codifica la fosfolipasa extracelular ExoU, que podría participar en la degradación de la matriz celular de nemátodos. Mediante zimografía en geles de gelatina se determinó la secreción de una proteasa de 49 kDa. Zimografía en geles de tributirina, demostraron la secreción de dos lipasas (50 kDa y 69 kDa). Análisis de espectrometría de masas (MALDI-TOF) permitió la identificación de la proteasa AprA y de las lipasas, LipA y ExoU. Ensayos de exposición de X. index con el extracto de proteínas del sobrenadante durante 3 h produjo la muerte del nemátodo. Estudios de microscopía de barrido demostraron que los nemátodos sufrieron distintos grados de destrucción de su cutícula. Posteriormente, se clonaron los genes que codifican estas enzimas en vectores de entrada y expresión de la serie Gateway, utilizando como huésped heterólogo la bacteria Escherichia coli BL21(DE3). Ensayos enzimáticos de extractos de enzimas recombinantes, AprA, LipA y ExoU, en los sustratos gelatina, tributirina y sangre, respectivamente, evidenciaron la funcionalidad de estas enzimas. La exposición de los extractos de proteínas enriquecidos con las enzimas AprA (500 μg/mL), LipA (50 μg/mL) y ExoU (50 μg/mL) recombinantes sobre X. index provocaron pérdida de movilidad mayor a 90% después de 2 h de incubación a temperatura ambiente. Se observaron, mediante microscopía electrónica de barrido, daños estructurales en la cutícula, deshidratación y exposición de tejidos internos de los nemátodos incubados con los extractos de enzima recombinante. Estos resultados permitieron confirmar que, al menos, uno de los mecanismos empleados por la cepa R4 para ejercer su actividad nematicida está dado por la secreción de enzimas extracelulares. Las lipasas, ExoU y LipA, no han sido previamente descritas como factores nematicidas en Pseudomonas.The bacterium Pseudomonas veronii R4 isolated from grapevine rhizosphere, possess high nematicide activity against Xiphinema index. This nematode is the vector of the grapevine fanleaf virus, the most significant viral agent that affects this crop. P. veronii R4 is phylogenetically related to P. fluorescens strains, that secrets a set of extracellular enzymes that are involved in their biocontrol activity. The hypothesis of the thesis is that the strain R4 exerts its nematicide activity against X. index by means of the secretion of hydrolytic enzymes. The specific aims are: (i) to identify the genes in P. veronii R4 genome that could participate in its nematicidal activity; (ii) to identify differentially expressed genes in this strain by the interaction with X. index; (iii) to evaluate nematicidal activity of strain R4 candidate genes. The analysis of the P. veronii R4 sequenced genome revealed the genes encoding extracellular enzymes and proteins from a secretion system. The sequencing and analysis of the P. veronii R4 transcriptome exposed to X. index extract indicated that this strain can sense the nematode proteins and sugars as carbon and nitrogen sources, inducing transport genes. The induction of the gene encoding the extracellular phospholipase ExoU was observed. Gelatin gels zymography indicated the presence of a 49 kDa protease. Tributyrine gels zymography demonstrated the secretion of two lipases (50 kDa y 69 kDa). Identification of the protease AprA and the lipases LipA and ExoU was done by MALDI-TOF Mass spectrometry analysis. X. index incubated during 3 h with the protein extract from the supernatant induced nematode death. Scanning electron microscope studies showed cuticle damage in the nematodes. The genes encoding these enzymes (aprA, lipA, exoU) were cloned in Gateway entry and destination vectors, using Escherichia coli BL21 (DE3) as heterologous host. Enzymatic assays of the recombinant enzymes extract, AprA, LipA y ExoU, in gelatin, tributyrine and blood respectively, confirmed the functionality of these enzymes. The incubation of the protein extracts enriched with the recombinant enzymes AprA (500 μg/mL), LipA (50 μg/mL) and ExoU (50 μg/mL) with X. index induce a motility loss > 90% after 2 h of incubation at room temperature. Structural damage to the cuticle, dehydration and exposition of the internal tissue of the nematodes incubated with the recombinant enzyme extract were observed by scanning electron microscope. These results confirmed that the strain R4 exerts its nematicidal activity by the secretion of extracellular enzymes. The lipases ExoU and LipA, have not been previously described as nematicidal factors in Pseudomonas.PFCHA-BecasPFCHA-Becas