Tesis Doctorado
Regulación de los niveles intracelulares del represor transcripciónal fur de acidithióbacillus ferrooxidans
Autor
Lefimil-Puente, Claudia Andrea
Institución
Resumen
El hierro es un nutriente esencial para todos los organismos, pero en exceso conduce a daño macromolecular vía estrés oxidativo (reacción de Fenton). El regulador transcripcional Fur (Ferric Uptake Regulator) ha sidomostrado de ser el responsable en coordinar los procesos fisiológicosinvolucrados en la captación, incorporación y almacenamiento (homeostasis) de hierro en todas las bacterias Gram negativas estudiadas a la fecha. At. ferrooxidans, una bacteria Gram negativa, es un interesante e inusual modelo para estudiar la homeostasis de hierro debido a que vive a pH 2 donde la biodisponibilidad de hierro es muy alta, y porque además necesita balancear el uso de hierro como un micronutriente versus su uso como fuente de energía. En muchos organismos estudiados, Fur ha sido encontrado en elevados niveles intracelulares pero muy poco es conocido sobre los mecanismos moleculares involucrados en la regulación de su expresión.En esta tesis, se observó que los niveles de Fur en At. ferrooxidansvarían dependiendo de la fase de crecimiento en que se encuentre la bacteria, incrementándose en fase logarítmica tardía. Sin embargo, estos cambios no fueron debidos a variaciones en los niveles de mRNA de FurAF, quepermanecen constantes. También se determinó que ambos, el mRNA y laproteína FurAF, varían en respuesta a cambios en el sustrato energéticoutilizado en el medio de cultivo, sugiriendo la posibilidad de que estasvariaciones se deban a regulación a nivel transcripcional y post-transcripcional.Predicciones bioinformáticas de sitios de unión a factores de transcripción en la región promotora de furAF, o cercana a ésta, junto a los ensayos in vivo de expresión de genes en el sistema heterólogo de E. coli son consistentes con la idea de que furAF puede ser transcrito por la RNA polimerasa asociada a diferentes factores sigma, incluyendo sigma70, sigma32 y sigma54. Predicciones bioinformáticas también sugieren que la transcripción de furAF podría ser regulada por el activador CRP (CAP) indicando un potencial nexo entre el metabolismo del carbono y la homeostasis de hierro.El análisis de estabilidad del mRNA de furAF mostraron que éste posee una elevada vida media de 0,5-4 horas (comparada con 1-20 minutos para untípico mRNA), y que su vida media varía dependiendo del medio de cultivo enque At. ferrooxidans es crecido.Además, se detectó un RNA, denominado frr, que es transcrito de manera antisentido a fur. Análisis de su transcripción, incluyendo su sitiopromotor y terminador, acoplado con una predicción de su estructurasecundaria sugieren un modelo en que Frr puede unir el mRNA de FurAF promoviendo el acceso del ribosoma e incrementando los niveles de FurAF. Este es un nuevo mecanismo para la regulación post-transcripcional de Fur.Se reportó evidencia preliminar de que FurAF posee un centro Fe-S quees requerido para su unión a sitios regulatorios en el DNA, conocidos comocajas fur. Esto sugiere que un mecanismo regulatorio post-traduccional podríaestar involucrado, donde FurAF pueda responder a estrés oxidativo, modulandoel centro Fe-S y afectando su habilidad de unir cajas fur.Finalmente se presenta evidencia in vitro e in vivo de que FurAF requierela presencia de manganeso para reconocer y unir la caja fur del promotor demnth, cuyo producto está involucrado en transporte de hierro en la célula.Estos resultados corroboran los mecanismos de regulación de Fur enAt. ferrooxidans que han sido observados en otros organismos y, más importante aún, sugieren que FurAF exhibe características adicionales deregulación no descritas anteriormente.Esta tesis establece el marco de trabajo para futuras investigacionesdirigidas a explorar cómo estas nuevas capacidades regulatorias podrían estarinvolucradas en respuestas nicho específicas a altas cargas de hierro a pH bajo y en la coordinación de la homeostasis del hierro y el metabolismo energético del hierro, específico en At. ferrooxidans. PFCHA-Becas Doctor en Biotecnología 169p. PFCHA-Becas TERMINADA