Knotted proteins constitute a group of topologically complex proteins whose backbone chain entangles in the folded state. During folding, these proteins has to thread one end of the polypeptide chain through a knotting loop in order to reach the native state. It has been suggested that the threading of the polypeptide chain is the limiting step during the folding reaction and is favored by the formation of non-native contacts. This has not been experimentally proven due to the fact that knotted proteins remain knotted when they are exposed to high concentrations of chemical denaturants. Therefore, it is difficult to study the threading in vitro. To address these problems, it has been studied the folding mechanism of MJ0366 protein from Methanocaldococcus jannaschii. We studied the folding mechanism of MJ0366 by using classical chemical denaturation studies and single molecule approaches. MJ0366 was observed as a dimer in solution whose folding mechanism studied by chemical denaturation showed to be a four-state mechanism. In equilibrium unfolding experiments the native dimer (N2) dissociates at low GdnHCl concentrations without changes in the secondary structure, where the native monomer (M) follow a cooperative single unfolding transition stabilized by 9 kcal/mol. However, during the kinetic experiments a burst-phase intermediate (I) showed up. This intermediate is formed during the dead time of the stopped flow experiment which is 7.7 ms. Nonetheless, from chemical denaturation experiments is impossible to determine if the polypeptide chain is fully unknotted in the unfolded state. Consequently, in order to control the topology of the unfolded state the optical tweezer experimental setup was used. Specifically, four pulling geometries were designed to mechanically unfold the monomer of MJ0366 to either tight the knot upon unfolding (KN mutant) or to untie it (UKs mutants). When the knot was tightened in force-ramp experiments, single unfolding and refolding transitions were observed, accompanied by a change in Lc consistent with the expected theoretical value. Using the Crooks fluctuation theorem, a 13 kcal/mol free energy difference was calculated from the unfolding and refolding work distributions. Moreover, at constant-force experiments the protein oscillates between two states, whose frequency of interconversion showed a linear dependence with force. From these results a refolding constant in the order of 107 s-1 was calculated. These observations suggest a two-state folding mechanism when the trefoil knot remains in the polypeptide chain whose refolding is extremely fast. To untie the knot, three different pulling geometries were designed to control which polypeptide end thread the polypeptide chain. When the C-terminal was free to thread (UK-C and N-UK-C mutants), single unfolding transitions with a Lc consistent for the fully unfolded/unknotted proteins were observed. This suggest that both mutants can properly refold at low forces. As refolding was not observed during the relaxing cycle for UK-C and N-UK-C mutants the refolding probability, as a chance to observe an unfolding event, was used to obtain the refolding kinetics. The refolding constant for the UK-C mutant was an order of magnitude of 10-1 s-1. This is remarkably slower than that observed with the KN mutant, suggesting that the threading of the polypeptide chain increases the energy barrier of folding in MJ0366. Using the rate constants at zero force, a free energy difference of 3 kcal/mol was calculated. Since the unfolding rate constants for KN and UK-C and the stability calculated by chemical denaturation were similar, the main difference is regarded to the refolding energy barrier. In consequence, the unfolded state is 10 kcal/mol destabilized when the knot remains in this state. On the other hand, when the N-terminal was free to thread (N-UK mutant), it folds into a misfolded state since unfolding and refolding transitions present a Lc ~46% shorter than the expected. These results indicate that during the folding of MJ0366, the threading of the polypeptide chain occurs by C-terminal and this process is the limiting step of the reaction with an energy cost of 10 kcal/mol. Chemical denaturation experiments were performed to study the stability of the KN and UKs mutants showing a free energy difference of 6 kcal/mol for the four mutants. This value is similar to that obtained when the knot is untied in the unfolded state with the UK-C mutant. Thus, is suggested that upon chemical denaturation the knot of MJ0366 is untied. Finally, it has been studied the relevance of specific non-native contacts during the threading of the polypeptide chain by explicit solvent molecular dynamics. The non-native contacts proposed to form are R91-E34 and R45-E34, therefore E34Q, R45A and R91A mutants were performed and studied by chemical denaturation. It was observed that these mutations did not affect the refolding constant. Hence, this suggest that at least these specific non-native interactions are not relevant for the formation of the transition state of the limiting step during folding of MJ0366, ergo, are not relevant for the threading of the polypeptide chain. In summary, from this thesis it was obtained for the first time a full kinetic and thermodynamic description for a natural knotted protein. From this information it was determined that the energy cost of threading the polypeptide chain in the unfolded state is 10 kcal/mol. This value, which is similar to the entropic cost of thread the backbone in the unfolded state, is explained almost completely by an increase in the refolding energy barrier when the backbone requires the threading to reach the energy minimum. Therefore, the threading of the polypeptide chain is the limiting step during the folding of knotted proteins and that non-native contacts are not necessary for MJ0366 folding.Las proteínas anudadas constituyen un grupo de proteínas que son topológicamente complejas, cuya cadena polipeptídica forma un nudo en el estado plegado. Durante la reacción de plegamiento, estas proteínas deben enhebrar uno de los extremos de la cadena polipeptídica a través de un loop para alcanzar el estado nativo. Se ha sugerido que este proceso es la etapa limitante durante el plegamiento de proteínas anudadas y que se ve favorecido por la formación de contactos no nativos. Esto no se ha demostrado experimentalmente, debido a que se ha observado que frente a altas concentraciones de denaturantes químicos el nudo permanece en el estado desplegado. Por lo tanto, es difícil estudiar el enhebrado de la cadena polipeptídica in vitro. Para resolver estos problemas en el desarrollo de esta tesis se ha trabajado con la proteína MJ0366 de Methanocaldococcus jannaschii, descrita como una proteína anudada con topología 31. Se estudió el mecanismo de plegamiento de esta proteína mediante aproximaciones clásicas utilizando agentes denaturantes químicos y mediante la manipulación a nivel de molécula individual con pinzas ópticas. Se observó que MJ0366 es un dímero en solución cuyo mecanismo de plegamiento seguido por desnaturación química es de cuatro estados. En experimentos de desplegamiento en condiciones de equilibrio, se observó que el dímero nativo (N2) se disocia a bajas concentraciones de GdnHCl sin manifestar cambios en el contenido de estructura secundaria. Frente a concentraciones crecientes de agente caotrópico, se observó una única transición que corresponde al desplegamiento del monómero nativo (M) que se encuentra estabilizado por alrededor de 9 kcal/mol. Sin embargo, a partir de los experimentos cinéticos utilizando un aditamento de paro de flujo (7,7 ms), se observó la aparición de un intermediario (I) que se forma durante el tiempo muerto del experimento. Sin embargo, a partir de estos experimentos no se puede determinar cuando ocurre el enhebrado ni si realmente la proteína se desata frente a desnaturación química. Por lo tanto, para controlar la topología del estado desplegado se utilizó la metodología de pinzas ópticas. Se diseñaron cuatro geometrías de estiramiento sobre el monómero de MJ0366, una para apretar el nudo (mutante KN) y tres para desatarlo frente a perturbación mecánica (mutantes UKs). Cuando el nudo se apretó en experimentos a velocidad constante, se observaron transiciones únicas de desplegamiento y replegamiento, cuyo largo de contorno (Lc) es consistente con el valor teórico. Usando el teorema de fluctuaciones de Crooks se calculó una diferencia de energía libre de 13 kcal/mol a partir de las distribuciones de trabajo de desplegamiento y replegamiento. Adicionalmente, experimentos realizados a fuerza constante mostraron que la proteína fluctúa sólo entre dos estados, cuyas frecuencias de interconversión muestran una dependencia lineal con la fuerza. A partir de estos resultados, se obtuvo una constante de replegamiento en el orden de los 107 s-1. Estas observaciones sugieren que el monómero de MJ0366 tiene un mecanismo de plegamiento de dos estados cuando el nudo es apretado frente a desplegamiento mecánico y cuyo replegamiento es extremadamente rápido. Para desatar el nudo, se diseñaron tres geometrías de estiramiento, para controlar que extremo de la cadena está disponible para enhebrar la cadena polipeptídica. Cuando el C-terminal se encuentra libre (mutantes UK-C y N-UK-C), se observaron transiciones de desplegamiento únicas con un Lc consistente para el desplegamiento al desatar totalmente de las proteínas. Esto sugiere que ambas mutantes pueden replegarse efectivamente a bajas fuerzas. Como el replegamiento no se observó durante el ciclo de relajamiento para las mutantes UK-C y N-UK-C, se accedió a esta información cinética a partir de las probabilidades de replegamiento. Esto se calculó como la probabilidad de ver o no un evento de desplegamiento frente a diferentes tiempos de espera a baja fuerza. Utilizando la mutante UK-C se obtuvo una constante cinética de replegamiento en el orden de los 10-1 s-1, esto es notoriamente más lento que lo observado para la mutante KN. Esto sugiere que el enhebrado de la cadena polipeptídica aumenta la barrera energética de plegamiento en MJ0366. Se calculó la diferencia de energía libre para la mutante UK-C mediante el uso de las constantes cinéticas y se obtuvo un valor de 3 kcal/mol. Como las cinéticas de desplegamiento de las mutantes UK-C y KN, así como sus diferencias de energía frente a desnaturación química, son iguales se sugiere que la principal diferencia energética se debe a la barrera de replegamiento. De esta manera el estado desplegado es 10 kcal/mol más estable que cuando el nudo permanece en este estado. Por otro lado, cuando el enhebrado es forzado a ocurrir vía el N-terminal (mutante N-UK), esta mutante mostró transiciones únicas de desplegamiento y replegamiento cuyo Lc es 46% más corto de lo esperado. Estos resultados indican que MJ0366 se pliega enhebrando el extremo carboxilo de la cadena polipeptídica y que dicho proceso es la etapa limitante en la reacción de plegamiento con un costo energético de 10 kcal/mol. Se realizaron experimentos de desnaturación química para estudiar la estabilidad de las mutantes KN y UKs, donde se observó una diferencia de energía libre de 6 kcal/mol para las cuatro mutantes. Este valor es cercano al obtenido cuando el nudo se desata por pinzas ópticas, por lo tanto, se sugiere que frente a desnaturación química la cadena polipeptídica de MJ0366 se desata. Finalmente, se estudió la relevancia de la formación de contactos no nativos específicos durante el enhebrado de la cadena polipeptídica de MJ0366. Dichos contactos no nativos son los puentes salinos R91-E34 y R45-E34, por lo tanto, se realizaron las mutaciones puntuales E34Q, R45A y R91A. Se observó que estas mutaciones puntuales no afectaron mayormente el contenido de estructura secundaria, ni la estabilidad de MJ0366. Del mismo modo, se observó que las cinéticas de replegamiento de las mutantes son similares a la de la proteína silvestre. Por lo tanto, se sugiere que al menos estos contactos no nativos específicos no son relevantes para la formación del estado de transición de la etapa limitante en el plegamiento de MJ0366. En síntesis, en el desarrollo de esta tesis se realizó por primera vez una descripción cinética y termodinámica completa para el mecanismo de una proteína pequeña naturalmente anudada. Se determinó que el costo energético de anudar una cadena polipeptídica en el estado desplegado es de 10 kcal/mol. Este valor, que se asemeja al costo entrópico de anudar una proteína en el estado desplegado, se explica en su mayoría al incremento de la barrera de replegamiento cuando la cadena requiere enhebrarse para alcanzar el mínimo energético. Por lo tanto, se concluye que el enhebrado es la etapa limitante en el plegamiento de proteínas anudadas y adicionalmente que la formación de contactos no nativos no es necesaria en el plegamiento de MJ0366.PFCHA-BecasEstamos en proceso de publicar resultados de la tesis en una revista científicaPFCHA-Becas