Tesis Magíster
Producción de anticuerpos de alta afinidad para la cuantificación de mollerosina en harinas de pescado mediante elisa.
Autor
Carrasco-Filselcker, Isabel Margarita
Institución
Resumen
En los últimos años, ha quedado en evidencia la necesidad que tienen los productores
y usuarios de harinas de pescado, de certificar algunos compuestos biológicamente activos
producidos durante su elaboración. En el caso de la producción de pollos Broiler, sufren
patologías causadas por algunas aminas biogénicas presentes en harinas de pescado, que es
el componente proteico básico de su alimentación. Una de estas enfermedades,
denominada vómito negro, es producida por mollerosina (GZ), compuesto que en
concentraciones en torno a 1 ppm produce una severa ulceración de la molleja,
probablemente como resultado de una sobreproducción de ácido por el proventrículo
debida a la estimulación de este análogo de la histamina sobre los receptores H-2.
Actualmente, no se dispone de un ensayo in vitro para la cuantificación de
mollerosina en harinas de pescado. Se evalúa mediante un análisis biotoxicológico con
pollos de cuatro días, que siendo sensible y confiable, es lento (15 días) y no permite la
cuantificación del compuesto. Es evidente que la certificación de mollerosina se
simplificaría enormemente si se dispusiera de un inmunoensayo -tipo MA o ELISA- para
su dosaje. La ausencia de este tipo de ensayos se explica porque el desarrollo de
anticuerpos contra la mollerosina es técnicamente complicado por tratarse de un hapteno
(Mr 240), razón por la cual, para producirlos es necesario unirla químicamente a proteínas
transportadoras, haciendo dependiente la unión de los anticuerpos del ambiente fisicoquímico
del transportador.
En Chile, se producen aproximadamente 1.200.000 toneladas al afo de harina de
pescado y se certifican para erosión de molleja y vómito negro, entre 300.000 y 400.000
toneladas anuales, a un costo que varia entre US$ 50 y US$ 100 por cada análisis. Es
importante destacar que no se produce un mayor incremento en el valor de la harina que es
certificada como biotoxicológicamente apta para ser utilizada en producción avícola, lo
que se obtiene es una mejor oportunidad de venta y una mayor competitividad para un
producto de exportación clave en la economía chilena. En este trabajo, se desarrolló una metodología para producir anticuerpos
policlonales y monoclonales contra GZ sintética y se establecieron algunas bases para
implementar un ELISA de competencia que permita su cuantificación en el futuro.
Además, se inició el estudio de las condiciones para solubilizar este compuesto en muestras
de harina de pescado mediante hidrolisis ácida y también, a través de enzimas proteolíticas.
Para producir los anticuerpos, se inmunizaron en forma paralela conejos y ratones
con diferentes conjugados, en los cuales GZ se acopló quimicamente a hemocianina de
Concholepas concholepas (CCH) o albúmina de suero de bovino (BSA) vía glutaraldehído
o carbodiimida, en tampón citrato o borato. Se encontró que el conjugado más
inmunogémco -determinado mediante el título de anticuerpos séricos de los animales de
experimentación mediante un ELISA directo- ftie GZ acoplada a hemocianina con
glutaraldehído en ambiente alcalino. Se debe mencionar que en el suero de ambas especies
se encontró reacción cruzada con histamina -el principal compuesto presente en harina de
pescado relacionado estructuralmente con mollerosina- reactividad que en el caso de los
anticuerpos policlonales de conejo se eliminó purificándolos mediante una columna de
afinidad de Sepharosa-histamina.
Con los ratones que presentaron mejor título de anticuerpos séricos contra GZ, se
realizaron dos fusiones somáticas utilizando linfocitos esplénicos y células de la línea
mieloide NSO/2. La selección primaria de los hibndomas secretores de anticuerpos antimollerosina
se realizó mediante un ELISA directo, similar al utilizado para titular los
animales de experimentación, con mollerosina unida a BSA con glutaraldehído y como
controles, BSA sola y BSA tratada con glutaraldehído. Posteriormente, para determinar la
especificidad de los anticuerpos, se realizó un ELISA con histamina unida a BSA,
encontrándose que sólo 3 anticuerpos (denominados 3H4, 3H10 y 5B1, todos de isotipo
IgG1 ) no presentaron reacción cruzada con este compuesto. De los tres monoclonales anti-mollerosina, para desarrollar el ELISA se eligió el
anticuerpo anti-GZ 31-14 (con una constante de afinidad aparente para este compuesto de
6,1 x 108 M- 1) porque este hibridoma fue el que mostró el crecimiento más estable,
lográndose rápidamente su reclonación.
Se estudiaron diferentes parámetros para establecer un ELISA de competencia para
mollerosina. Entre ellos, la concentración de anticuerpo anti-GZ 3H4 unido a la fase
sólida, el grado de sustitución del conjugado mollerosina-peroxidasa y diferentes agentes
bloqueadores para elegir el que mostrara una menor señal de fondo.
Finalmente, los resultados de un ELISA de competencia con dicho anticuerpo
unido a la fase sólida y GZ sintetizada qulmicamente -ya sea coincubando el hapteno con el
conjugado o incubando primero con la solución de OZ y posteriormente con el conjugadomuestran
un desplazamiento de mollerosina marcada con peroxidasa entre 0,1 y 10 ug/mL
del hapteno. En estos experimentos se utilizó concentraciones del mollerosina e histamina
como control de especificidad, en un rango entre O y 100 g.tg/mL. Con histamina,
prácticamente no se observó desplazamiento.
Se concluye que si bien, este es el primer trabajo que reporta la obtención de un
anticuerpo monoclonal altamente específico contra mollerosina y su uso en el
establecimiento de un ELISA de competencia para cuantificar el compuesto sintético, es
necesario modificar las condiciones del ensayo para obtener una mayor sensibilidad. PFCHA-Becas Magister en Ciencias de los Alimentos 69p. PFCHA-Becas TERMINADA