Tesis Doctorado
Papel del lazo s3-s4 y el segmento s3 en la activación del canal de k+ shaker.
Autor
González-León, Carlos
Institución
Resumen
Los canales de potasio dependientes del potencial, como el canal Shaker, son tetrámeros formados por subunidades de seis segmentos de transmembranales (S1-S6) (Shih y Goldin, 1997). En ellos, las "partículas cargadas" capaces de "sentir" el potencial a través de la membrana resultaron ser aminoácidos básicos (argininas ó lisinas) que se encuentran en el segmento S4, propuesto como el sensor de potencial (Liman y col., 1991; Papazian y col., 1991; Bezanilla y col, 1991; Perozo y col., 1994; Aggarwal y
MacKinnon, 1996; Larsson y col., 1996; Mannuzzu y col., 1996; Seoh y col., 1996; Yang y col., 1996; Yussaf y col., 1996; Smith-Maxwell y col. 1998a y b; Díaz y col., 1998, Ledwell y Aldrich, 1999; Latorre y col, 2003). Sin embargo, aún no existe un consenso acerca de qué otros segmentos ó regiones, diferentes al S4, podrían estructurar al sensor de potencial, y cuál sería el mecanismo mediante el cuál estos canales detectan los cambios de voltaje para su activación.
Por ello, este trabajo estuvo dirigido a dilucidar el papel de regiones estructurales muy cercanas al S4, como el lazo 53-S4 y el segmento S3, en la activación del canal de K Shaker. Teniendo en cuenta que la distancia exacta que se mueve el sensor de potencial es desconocida, pensamos que movimientos grandes del segmento S4 deberían estar restringidos por la longitud del lazo S3-S4. Para comprobar esta hipótesis se construyeron mutantes de eliminación con lazos S3-S4 de diferentes largos, hasta la
completa eliminación del mismo, así como mutantes sin lazo S3-S4 y con deleciones en el segmento S3b. Los resultados muestran que la eliminación total del lazo S3-S4 no afecta la probabilidad máxima de que los canales estén abiertos, y sin embargo, modifica a la mitad el número total de 13 cargas de compuerta para el canal Shaker, haciendo poco probable un desplazamiento muy grande (15 A) para el segmento S4. Por otro lado, tanto las constantes de tiempo de la activación del canal Shaker, como el
punto medio de las curvas de activación por potencial, varían periódicamente en función del largo del lazo. En mutantes con lazos de menos de 7 aminoácidos hacia el C-terminal, es posible demostrar que esta periodicidad es típica de una estructura de a-hélices. De ser esta región una continuación natural del segmento S4, esta sería una demostración indirecta de que el segmento S4 tiene una estructura en a-hélice.
La eliminación del lazo S3-S4 y de parte del segmento S3b (desde leucina 327 hasta la isoleucina 360) origina una dramática disminución de la probabilidad máxima de encontrar los canales abiertos. Estas proteínas no son funcionales si se continúan eliminando los aminoácidos del segmento S3b. Sorprendentemente, la expresión ó funcionalidad de estos canales se vuelve a recuperar, cuando se ha eliminado el lazo S3-S4 y todo el S3b.
Estos resultados indican que el segmento S3b no es vital para la activación del canal Shaker. Para el caso de los mutantes de eliminación del segmento S3b, encontramos
también un comportamiento periódico entre las constantes de tiempo y la cantidad de aminoácidos presente en esta región de la proteína. Sin
embargo, a diferencia de la periodicidad hallada hacia el C-terminal del lazo S3-S4, nosotros encontramos un punto de quiebre de dicho comportamiento
periódico, en la treonina 329. Un resultado similar se encontró, al realizar la dinámica molecular de esta región por lns en H 20. Dicho resultado apuntó
no sólo a una coincidencia en el punto de quiebre de esta hélice (treonina-329), sino que permitió comprobar que un medio acuoso, la hélice mantiene
su estructura secundaria. Sorprendentemente coincidentes, fueron también los valores determinados para el ángulo de desfase (153°) entre ambas
hélices, obtenido por la simulación de esta región, en relación al obtenido de los datos experimentales (1580).
Por otro lado, a fin de dilucidar la posible participación del S3 como componente del sensor de voltaje en el canal Shaker, nosotros generamos
mutantes con cisteínas ubicadas a todo lo largo del segmento S3b de diferentes largos de lazo S3-S4, y mutantes con cargas positivas en dicho
segmento. Los estudios de sustitución por cisteínas en diferentes posiciones del segmento S3b, develaron una reactividad a MTSET, independientemente de la longitud del lazo S3-S4, y sin grandes diferencias de los valores de constantes de reacción, atendiendo al estado cerrado ó abierto del canal. Sin embargo, los valores de constante de reacción obtenidas fueron del orden de 1 mMs, diferentes en dos ordenes de magnitud al valor reportado para la reacción de MTSET con cisteínas libres.
Este resultado nos permitió concluir que si bien, el MTSET es accesible hasta la posición 1-315 del canal, existe un impedimento estérico para la
reacción del reactivo con las cisteínas del canal. Sobre la base de estos resultados, nosotros pensamos que esta región no está expuesta
completamente hacia el lado extracelular, sino que se encuentra en el interior de la membrana formando una cavidad a la que el MTSET tiene
acceso hasta la posición 1-315. Este resultado fue corroborado al realizar un "docking" entre el MTSET y el S3b con cisteínas estructurado como una cavidad con grietas ó hoyos acuosos a los que accedió el reactivo hasta la posición 1-315.
Por último, el hecho agregar una carga positiva a la estructura del S3b (T326R) y no detectar cambios del número total de cargas de compuerta,
durante la activación del canal, se interpreta como que el segmento S3 no se mueve. Por otra parte, nuestros resultados también apuntan a que el
modelo de "remo ó paleta" propuesto para la primera estructura cristalina del sensor, en el caso particular del canal Shaker, es incorrecto.
Nosotros concluimos que un modelo de desplazamiento muy pequeño para el sensor de voltaje, sin un papel protagónico ni para el lazo S3-S4, ni el
segmento S3, sería el adecuado, durante la activación del canal de K Shaker. PFCHA-Becas Doctor en Ciencias Mención en Biología Molecular, Celular y Neurociencias 233p. PFCHA-Becas TERMINADA