Tesis Doctorado
Participación de una ca2+ -atpasa en la remoción de ca2+ de los ciliós de las neuronas olfatorias.
Autor
Castillo-Huera, Karen Lorena
Institución
Resumen
En este trabajo de tesis se investigó si hay una Ca 2 -ATPasa de membrana
plasmática (PMCA) expresándose en los cilios olfatorios y si ésta participa en la
extracción del Ca 2desde el lumen luego de producirse un incremento de este ión en
dicho organelo. Evidencias previas indicaban que un intercambiador NaICa2 (NCX) era
el responsable de la remoción del Ca 2desde los cilios.
La expresión y distribución de la PMCA y del NCX se indagó mediante western
blot en vesículas de membranas ciliares purificadas de neuronas olfatorias,
inmunocitoquímica en células disociadas de epitelio olfatorio e inmunohistoquímica de
cortes de epitelio olfatorio. La PMCA, en efecto, se expresa en los organelos sensoriales
del olfato, mostrando una distribución discreta a lo largo de estos. La actividad de esta
bomba se caracterizó midiendo la acumulación de 45Ca2 en vesículas invertidas
purificadas de cilios olfatorios. Se determinó que su actividad es dependiente del Ca 2
intracelular (Ko.5 = 670 nM). La bomba incrementa sus niveles de actividad -5 veces al
aumentar la concentración de Ca 2libre a partir de 300 nM con un máximo de actividad
a -1 xM Ca2 . El Ca2regula la actividad de la bomba mediante calmodulina (K0.5 = 31
nM). La actividad de la bomba es inhibida en ausencia nominal de ATP, así como
cuando es expuesta al bloqueador carboxyeosina (CE) y al inhibidor de CaM
calmidazolio. Las características bioquímicas de la bomba indican que la PMCA ciliar
podría pertenecer a las isoformas 1 ó 4. Las 4 isoformas de la PMCA se expresan en las
membranas ciliares, pareciendo estar más representada la PMCA 4 respecto de las otras tres. La participación funcional de la PMCA en la remoción de Ca 2ciliar, así como la
del NCX, se estudió determinando la constante de relajación (t) de la corriente total de
C1 activada por Ca2 (Icaci) como indicador del Ca 2intraciliar, luego de activar esta
corriente mediante un aumento rápido de Ca 2t En condición control, la 'CaCI presentó
una t = 272 ± 78 ms. Este valor aumentó al inhibir la PMCA con 100 pM CE (t = 2181
± 437 ms), omitiendo el ATP en la pipeta de registro (t = 666 ± 49 ms) y alcalinizando
el medio extracelular a pH 9,4 (r = 725 ± 65 ms). A su vez, al anular el NCX
reemplazando el Na extracelular por Li, la constante de relajación de la corriente de
transducción también aumentó ('r = 442 ± 8 ms). La prolongación de la 't de la TaCa
sugiere que el Ca 2permanecía elevado por un mayor tiempo en los cilios en dichas
condiciones. Estas evidencias respaldan fuertemente que tanto la PMCA como el NCX
extraen Ca 2desde los cilios en las condiciones experimentales utilizadas.
Por otro lado, se midió el curso temporal de la remoción del Ca 24desde los cilios
mediante microscopía de 2 fotones, luego de producir un incremento abrupto del Ca 2
por fotoliberación de cAMP enjaulado. La relajación de la señal fluorescente debida a la
recuperación de la concentración de Ca 2del estado de reposo en la condición control
presentó una To.s = 12,5 ± 2,3 s. Ésta se prolongó al bloquear la PMCA con CE 50 ViM
(t05 = 30,18 ± 6,4 s) y al anular funcionalmente el NCX reemplazando el Na externo
por Li (r. 5= 28,12 ± 5,2 s). Estos resultados indican que tanto la PMCA como el NCX
participan en la remoción del Ca 2luminal.
El incremento de Ca2en los cilios olfatorios ocurría de manera altamente
localizada a lo largo del organelo, observándose destellos de fluorescencia en sitios discretos al fotoactivar el cAMP enjaulado. Los tamaños promedio de dichos sitios de
entrada de Ca 2eran variables en las distintas condiciones exploradas. Estos sitios se
dividieron arbitrariamente en cuatro grupos: aquellos menores a 0,4 tm; entre 0,4 y 0,6
p.m; entre 0,6 y 0,8 j.im; y los que eran mayores a 0,9 ptm de ancho. En condiciones
control se observó habitualmente tamaños de 0.39 + 0.08 p.m (n20) y 0.54 ± 0.03 p.m
(n=17). El ancho de estos sitios fue mayor cuando las NSO estuvieron previamente
expuestas a los bloqueadores del NCX y la PMCA alcanzando valores de 0.67 ± 0.05 .tm
(n=14) y 0.98 + 0.25 j.m (n13); sugiriendo que el ion Ca2se acumula en las cercanías
de estos lugares al estar bloqueados los mecanismos que lo extraen. Cuando las NSO son
expuestas a 1 mlvi del bloqueador de la PDE IBMX los puntos discretos de ingreso de
Ca2 se dispersan, posiblemente debido a una acumulación persistente del ión dentro del
cilio a causa de una mayor disponibilidad de cAMP, agonista de los canales CNG. La
remoción del colesterol, con ciclodextrina, de las membranas también suprimió las
señales localizadas de Ca 2 , observándose además un notable retardo en la entrada del
ion al cilio. Esto es consistente con una participación de dominios ricos en colesterol en
la formación y mantención de dichos sitios. Por otro lado, cuando se exploró la
distribución de la PMCA y el canal CNG, interesantemente se observó que ambas
proteínas colocalizaban y se distribuían de manera particulada a lo largo de los cilios.
Esto es congruente con una disposición localizada de los lugares por donde entra Ca 2al
cilio, sugiriendo que la maquinaria de quimiotransducción podría formar complejos
moleculares donde se agrupan los componentes de la transducción olfatoria. PFCHA-Becas Doctor en Ciencias Mención en Biología Molecular, Celular y Neurociencias 113p. PFCHA-Becas TERMINADA