Tesis Doctorado
Aislamiento y caracterización de la enzima ramnogalacturonano endoliasa inducida durante la maduración de frutos de Fragaria chiloensis (L) Mill.
Isolation and characterization of rhamnogalacturonan endolyase enzyme induced during the ripening of Fragaria chiloensis (L) Mill. fruit
Registration in:
21130658
Author
Méndez-Yáñez, Angela Arlette
Institutions
Abstract
La maduración de frutos es un proceso que involucra la sumatoria de eventos que ocurren a nivel molecular. La coordinación espacio-temporal de ellos favorece cambios que inducen el desarrollo de un fruto atractivo para el consumo, con cualidades particulares como aroma, sabor, textura y color, que lo hacen único. Particularmente, las modificaciones de la textura durante la maduración se encuentran estrechamente relacionadas con el metabolismo de la pared celular, donde se aprecia la activa participación de enzimas como glicosil hidrolasas y liasas.
Fragaria chiloensis (L.) Mill. es un fruto endémico de Chile con exóticas cualidades organolépticas, sin embargo su comercialización y consumo se ve dificultado a causa de su rápida pérdida de firmeza, responsable de su breve vida útil de postcosecha. Se ha comprobado que el principal polisacárido metabolizado y solubilizado durante la maduración de este fruto son las pectinas, principalmente ramnogalacturonano I (RG-I). Hoy en día, se conocen enzimas pertenecientes a la propia maquinaria molecular del fruto que actúan modificando las cadenas laterales de RG-I, no obstante la información reportada sobre la escisión del esqueleto central de este polisacárido es escasa.
A partir del transcriptoma de frutos de F. chiloensis, se identificó un contig que codificaría para una enzima con actividad catalítica sobre el esqueleto de RG-I, una ramnogalacturonano endoliasa (RGL4, EC number 4.2.2.23), cuyos niveles de FPKMs (Fragmentos por kilobase de exón por millón) incrementan a través del proceso de maduración del fruto. Se aisló la secuencia codificante completa de FchRGL1 de 3.328 pb, que codifica para una proteína de 676 residuos aminoacídicos. Por medio de análisis in silico se comprobó que ésta proteína presenta los tres dominios funcionales de las RG-liasas: dominio RGL4, fibronectina tipo III (FNIII) y módulo de unión a carbohidratos (CBM). Además, presenta los residuos aminoacídicos clave para la actividad enzimática y de coordinación con ion Ca2+. Mediante análisis de RT-qPCR se corroboró que la expresión del transcrito se incrementa a lo largo del proceso de maduración del fruto de F. chiloensis; también se expresa en tejidos en constante expansión como tallo, estolón y raíz. La cuantificación de actividad RG-liasa en extractos proteicos de fruto evidenció un notable incremento a medida que el fruto madura.
Se realizó el modelado por homología de la enzima, utilizando como estructura de referencia el cristal de una RG-liasa del hongo saprófito Aspergillus aculeatus, donde ambas secuencias comparten un 28% de identidad. El modelo fue evaluado con servidores bioinformáticos que permitieron determinar la construcción de una estructura robusta. La proteína fue colocada en una caja de agua neutralizada con CaCl2. Luego de 1,5 ns de dinámica molecular, la proteína alcanzó su estabilidad con un valor de RMSD de 5,4 Å.
La expresión heteróloga de la secuencia codificante (FchRGL1) en la levadura Pichia pastoris permitió purificar la proteína y con ella realizar la caracterización bioquímica. Las condiciones óptimas para la cuantificación de actividad enzimática son: pH 5,0, entre 20ºC y 30ºC, 0,2 mg/mL RG-I de papa como sustrato y presencia de 2 mM Ca2+. El valor de KM para RG-I de papa es de 0,2 mg/mL y Vmáx de 769,2 mU/mg. Adicionalmente, la enzima sufre inhibición a concentraciones elevadas de sustrato. Por otro lado, la enzima es capaz de degradar el mucílago producido por semillas de Arabidopsis thaliana en germinación que es rico en RG-I.
Tratamientos de frutos con hormonas permitieron demostrar que ABA induce la expresión del gen FchRGL1, mientras que AUX la inhibe. En el análisis in silico del promotor del gen que codifica para la enzima RG-liasa en Fragaria vesca, se observó la presencia de elementos en cis capaces de responder a dichas hormonas.
El conocer las propiedades de esta enzima que es capaz de degradar el esqueleto central de RG-I, componente importante de las pectinas, contribuye a comprender de mejor manera el desensamblaje de la pared celular que se produce durante la maduración de frutos de frutilla y que conduce al ablandamiento de los frutos y a su breve vida útil. Fruit ripening is a process that involves the sum of events that occur at the molecular level. The spatio-temporal coordination of them promotes several changes that induce the development of an attractive fruit to eat, with particular qualities such as aroma, taste, texture and color, which makes it unique. Particularly, texture modifications during ripening are closely related to the cell wall metabolism, where the active participation of enzymes such as glycosyl hydrolases and lyases is observed.
Fragaria chiloensis (L.) Mill. is a Chilean endemic fruit with exotic organoleptic properties, however its commercialization and consumption has been difficult due to its fast loss of firmness, responsible of its short postharvest shelf-life. It has been proven that the main cell wall polysaccharide metabolized and solubilized during ripening are the pectins, primarily rhamnogalacturonan I (RG-I). Nowadays, it is already known that enzymes belonging to the fruit molecular machinery act on the side chains of RG-I, however the information reported on the cleavage of the backbone of this polysaccharide is scarce.
From the transcriptome of F. chiloensisÅLs fruit a contig was identified that could code for an enzyme with catalytic activity on the backbone of RG-I, a rhamnogalacturonan endolyase (RGL4, EC number 4.2.2.23), whose FPKMs (Fragments Per Kilobase Million) values increased throughout the ripening process. The coding sequence of FchRGL1 of 3328 pb was isolated, which codes for a protein of 676 amino acid residues. In silico analysis demonstrated that the translated protein presents the three functional domains of RG-Lyases: RGL4 domain, fibronectin type III (FNIII) and carbohydrate binding module (CBM). In addition, it presents the key amino acid residues for activity and coordination with Ca2+. Analysis by RT-qPCR confirmed that the expression level of FchRGL1 transcripts increases throughout the ripening process of F. chiloensis fruit, and that it is also expressed in constantly expanding tissues such as stem, runners and roots. The quantification of RG-lyase activity in protein extracts prepared from fruits evidenced a remarkable increase as the fruit ripens.
The homology modeling of the enzyme was performed using as reference the structure of RG-lyase of the saprophyte fungus Aspergillus aculeatus, where both sequences share 28% identity. The model was evaluated with bioinformatic servers that allowed the construction of a robust structure. The protein was placed in a water box neutralized with CaCl2. After 1.5 ns of molecular dynamics, the protein reached its stability with a RMSD value of ~5.4 Å.
The heterologous expression of the coding sequence (FchRGL1) in Pichia pastoris allowed the purification of the protein and its biochemical characterization. The optimum conditions for the enzymatic assay are: pH 5.0, between 20.C and 30.C, 0.2 mg/mL of potato RG-I as substrate and the presence of 2 mM Ca2+ ions. The KM value for potato RG-I is 0.2 mg/mL and VMAX of 769.2 mU/μg. Additionally the enzyme undergoes inhibition at high substrate concentrations. On the other hand, the enzyme is able to degrade the mucilage produced by germinating Arabidopsis thaliana seeds which is rich in RG-I. Finally, the quantification of RG-lyase activity in fruit protein extracts showed a remarkable increase in RGL activity as the fruit ripens.
Hormonal treatments allowed us to demonstrate that ABA induces the expression of FchRGL1 gene, while AUX inhibits it. The in silico analysis of the promoter of the gene encoding for RG-lyase in Fragaria vesca contains cis elements able to respond to these hormones.
Knowing the properties of this enzyme that is capable to degrade the central backbone of RG-I, an important component of pectins, helps to better understand the disassembly of the cell wall that occurs during the ripening of strawberry fruits that leads to the softening of the fruit. PFCHA-Becas PFCHA-Becas