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Development of a technological-scientific platform for the identification of bioactive compounds from arrayan (Luma apiculata) and evaluation of the effect of nanoencapsulation on its bioaccessibility
Desarrollo de una plataforma científica-tecnológica para la identificación de compuestos bioactivos desde arrayán (Luma apiculata) y evaluación del efecto de la nanoencapsulación sobre su bioaccesibilidad
Registration in:
21161140
Author
Carrasco-Sandoval, Jonathan Raúl
Institutions
Abstract
Chronic non-communicable diseases (CNCD) are the leading cause of morbidity and mortality in Chile and constitute a national and international public health problem. Since CNCD incidence has continuously increased, the scientific community has studied many native species with important phenolic compounds content, which have shown positive effects over CNCD. Among the native species recognized for their medicinal properties, the arrayán (Luma apiculata) stands out due to its content of bioactive compounds in fruit and leaves, that could reduce the risk of suffering CNCD. However, the studies are very scarce. The objective of this work was to develop chemical-analytical methodologies to obtain scientific data for supporting the functional characteristics of arrayán fruit and leaf and to protect the identified bioactive compounds through nanotechnology. As a previous step, an ultrasound-assisted extraction process of phenolic compounds from quinoa seed was developed and optimized. Based on this procedure, the extraction process of phenolic compounds from arrayán fruits and leaves was established and optimized by means of ultrasound-assisted extraction. A full factorial design and a central composite design were used to optimize the extraction process.
Subsequently, the antioxidant capacity of raw extract and phenolic-rich extracts obtained by selective adsorption on the Amberlite XAD-7 polymeric resin were evaluated with the optimized extraction conditions. The antioxidant capacity was evaluated using two methodologies: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and ferric reducing antioxidant power (FRAP). In addition, the total phenolic content (TPC) using Folin-Ciocalteu methodology was determined. These assays showed that arrayán fruit and leaf extracts have a high phenolic compound concentration and a high antioxidant capacity, especially the phenolic-rich extracts. Further, an ultra-high-performance liquid chromatography (UHPLC) coupled to mass spectrometry (MS) method was implemented to establish the phenolic profile of raw extracts. The chromatographic analysis showed the presence of seven phenolic compounds in the raw fruit extract (quercetin 3-ß-D-glucoside, myricetin, quercetin, p-coumaric acid, kaempferol 3-glucoside, gallic acid and kaempferol) and five phenolic compounds in the raw leaf extract (quercetin 3-ß-D-glucoside, myricetin, quercetin, kaempferol 3-glucoside and gallic acid).
According to the phenolic profile and the antimicrobial effect reported for some identified phenolic compounds, the antiviral activity of raw extracts (30% ethanol) was determined against hepatitis A virus and murine norovirus, both associated with foodborne outbreaks. The leaves extract had a significant antiviral effect on both viruses, while the fruit extract had a moderate effect on the hepatitis A virus.
After establishing the phenolic profile, standard solutions were subjected to in vitro gastrointestinal digestion process to study their bioaccessibility. Simultaneously, the potentiality of three nanoparticulate systems (zein particles, alginate-coated zein particles, and alginate/chitosan complex-coated zein particles) were evaluated, which were prepared by nanoprecipitation and electrostatic deposition methods. The bioaccessible fraction of the bioactive compounds was determined by high-performance liquid chromatography with UV detection (HPLC/UV). Phenolic compounds presented limited bioaccessibility, which varied between 3.4 and 16.1%, while the three nanoparticulate systems significantly increased the bioaccessibility of all phenolic compounds, especially the alginate/chitosan complex-coated zein particles, which ranged between 65.8 and 84.0%.
Finally, a scientific-technological platform was implemented by HPTLC/(bio) autography/MS to detect and identify in the raw fruit and leaves extracts compounds with antioxidant and inhibitory activity against α-glucosidase and acetylcholinesterase enzymes, considered as therapeutic targets to treat type 2 diabetes mellitus and neurodegenerative diseases, respectively.
The leaves extract only presented bands with antioxidant activity, while the fruit extract presented a compound with significant antioxidant and inhibitory activity on both enzymes, which was tentatively identified by MS as fraxetin.
These results support the functional characteristic of arrayán fruit and leaves and demonstrate the nanotechnology potential (nanoparticulate systems) to protect the compounds responsible for this functionality. Las Enfermedades Crónicas No Transmisibles (ECNT) son la principal causa de morbimortalidad del país y representan un problema nacional e internacional de salud pública. Como resultado, muchas especies nativas/autóctonas han sido estudiadas por su potencial fuente de compuestos fenólicos, los cuales pueden contribuir a la prevención y/o tratamiento de dichas enfermedades. Dentro de las especies nativas reconocidas por sus propiedades medicinales se encuentra el arrayán (Luma apiculata), cuyos compuestos bioactivos presentes en el fruto y la hoja podrían ser un aporte relevante para disminuir el riesgo de padecer ECNT. Sin embargo, los estudios reportados de esta especie son muy escasos. En consecuencia, el presente trabajo de investigación tuvo como objetivo principal desarrollar metodologías químico-analíticas para obtener datos científicos que sustenten la característica funcional del fruto y hoja del arrayán y preservar los compuestos bioactivos identificados mediante el empleo de la nanotecnología.
Como paso previo al trabajo con arrayán, se desarrolló y optimizó un proceso de extracción asistida de ultrasonido de compuestos fenólicos desde semilla de quinoa. Basándose en este procedimiento, fue establecido y optimizado el proceso de extracción de dichos compuestos desde frutos y hojas de arrayán mediante extracción asistida por ultrasonido en baño ultrasónico. Esta optimización contempló un diseño factorial completo y un diseño central compuesto.
Con las condiciones de extracción optimizadas, se evaluó la capacidad antioxidante de los extractos crudos y extractos ricos en compuestos fenólicos obtenidos por adsorción selectiva sobre la resina polimérica Amberlita XAD-7. La capacidad antioxidante se evaluó mediante dos metodologías: 2,2- Difenil-1- picrilhidrazilo (DPPH) y capacidad antioxidante reductor del hierro (FRAP). Además, se determinó el contenido de fenoles totales mediante la metodología de Folin-Ciocalteu (TPC). De acuerdo con los ensayos realizados, quedó en evidencia que los extractos de fruto y hoja de arrayán presentan una elevada concentración de compuestos fenólicos y una alta capacidad antioxidante, en especial, los extractos ricos en compuestos fenólicos. Para establecer el perfil fenólico de los extractos crudos, se implementó un método por cromatografía líquida de ultra-alta eficiencia (UHPLC) acoplada a espectrometría de masas (MS). El análisis cromatográfico, reveló la presencia de siete compuestos fenólicos en el extracto crudo de fruto de arrayán (quercetin 3-β-D glucósido, miricetina, quercetina, ácido p-cumárico, kaempferol glucósido, ácido gálico y kaempferol) y cinco compuestos fenólicos en el extracto crudo de hoja (quercetina 3-ß-D-glucósido, kaempferol 3-glucósido, miricetina, quercetina y ácido gálico).
Considerando el perfil fenólico y el efecto antimicrobiano reportado para algunos de los compuestos fenólicos identificados, se determinó la actividad antiviral de extractos crudos (30% etanol) sobre el virus de la hepatitis A y norovirus murino, principales virus entéricos asociados a contaminación alimentaria. El extracto de hoja presentó un efecto antiviral significativo sobre ambos virus, mientras que el extracto de fruto tuvo un efecto moderado sobre el virus de la hepatitis A.
Luego de establecer el perfil fenólico, estándares de los compuestos fenólicos puros fueron sometidos a un proceso de digestión gastrointestinal in vitro para estudiar la bioaccesibilidad de dichos compuestos. Paralelamente, se evaluó la potencialidad de tres sistemas nanoparticulados (nanopartículas de zeina, zeína recubierta de alginato y zeína recubierta de complejo alginato/quitosano), los cuales fueron obtenidos mediante los métodos de nanoprecipitación y deposición electrostática. La fracción bioaccesible de los compuestos bioactivos fue determinada mediante cromatografía líquida de alta eficiencia asociada a detección UV (HPLC/UV). Los compuestos fenólicos presentaron una limitada bioaccesibilidad, que varió entre un 3.4 y 16.1%, mientras que los tres sistemas nanoparticulados incrementaron significativamente la bioaccesibilidad de todos los compuestos fenólicos, en especial, las nanoparticulas de zeina recubiertas con complejo de alginato/quitosano, la cual varió entre un 65.8 y 84.0%.
Finalmente, se implementó una plataforma científica-tecnológica por HPTLC/(bio)autografía/MS para detectar e identificar en los extractos crudos de fruto y hoja de arrayán compuestos con actividad antioxidante e inhibitoria sobre las enzimas α-glucosidasa y acetilcolinesterasa, consideradas como blancos terapéuticos para tratar la diabetes mellitus tipo 2 y enfermedades neurodegenerativas, respectivamente. El extracto de hoja sólo presentó bandas con actividad antioxidante, mientras que el extracto de fruto presentó un compuesto con marcada actividad antioxidante e inhibitoria sobre ambas enzimas, el cual fue identificado tentativamente mediante la interfaz TLC-MS como fraxetina (hidroxicumarina).
Estos resultados permiten sustentar la característica funcional del fruto y hoja de arrayán, además de demostrar el potencial de la nanotecnología (sistemas nanoparticulados) en la preservación de los compuestos responsables de dicha funcionalidad.