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Development of chitin nanoparticles that can enter, circulate and activate signals related to early defense in plants
Desarrollo de nanopartículas de quitina capaces de ingresar, circular y activar señales en plantas relacionadas con la defensa temprana
Autor
López-Jara, Miguel Abelardo
Institución
Resumen
The development of nanomaterials in agriculture is becoming more important due to their use in the delivery of bioactive molecules, genetic material, or improvements in soil and water (i.e. nutritionally, removal of contaminants, etc.). In this context, chitin and its derivatives could be excellent nanomaterials because they are suitable for use as nanoparticle matrix and elicitor. During this work, chitin nanoparticles (CNP) were synthetized by water in oil (W/O) emulsion, and their size, surface charge and composition was determined by dynamic light scattering, electrophoretic light scattering and enzymatic degradation by chitinases, respectively. To determine the movement of CNPs inside plants, FITC-labeled CNPs were applied on leaves or roots of 25-day-old Nicotiana benthamiana seedlings and FITC-associated fluorescence was observed in the adjacent part of the plant (root in foliar treatment or leaves in root treatment). Finally, the physiological effect of CNP was determined by measuring the expression of genes CERK1, STZ, ATL and MAPK3, which are activated in early defensive responses to chitin, and the production of reactive oxygen species (ROS) in 20-days-old N. benthamiana seedlings submerged for 1 hour with CNP. The CNPs had an average size of 280nm in diameter ± 12.88nm, a polydispersity of 0.229 ± 0.021 and a superficial charge of 26.9mV ± 1.06mV. Additionally, their chemical composition was corroborated by the disappearance of microaggregated CNPs after treatment with chitinases. In seedling of N. benthamiana treated with FITC-labeled CNPs, fluorescence was observed only in the primary root of seedlings treated in leaves, inside the root and adjacent to the inner surface. In contrast, when FITC-labeled CNPs was applied in the root, fluorescence associated with FITC was not observed in the leaf, despite the observed small CNPs superficial clusters aggregated on the root surface. Finally, an increased ROS production was detected in seedlings treated with CNP and an increment in expression of the analyzed genes was observed, except for the CERK1 gene, which decreased its expression. These results demonstrate the ability to generate CNP by emulsion, which can enter through leaves in N. benthamiana seedlings, spread inside the entire plant and activate early defense responses. El desarrollo de nanomateriales en agricultura está adquiriendo mayor importancia debido a su uso en la entrega de moléculas bioactivas, mejoras en el suelo y agua (por ejemplo, nutricionalmente, eliminación de contaminantes, etc.) o en la entrega de material genético. En este contexto, la quitina y sus derivados pueden ser un nanomaterial idóneo debido a su doble capacidad de ser matriz de nanopartículas y elicitor. Durante esta tesis de doctorado se generaron nanopartículas de quitina (NPQ) mediante emulsión W/O, las cuales fueron caracterizadas en tamaño, carga superficial y composición mediante dispersión dinámica de la luz, dispersión electroforética de la luz y degradación enzimática por quitinasas respectivamente Para determinar si las NPQ son capaces de movilizarse al interior de la planta, se realizaron aplicaciones de NPQ marcadas con FITC en hojas o raíces de plántulas de Nicotiana benthamiana de 25 días y se buscó fluorescencia asociada a FITC en el tejido adyacente (raíz en aplicación foliar u hojas en aplicación radicular). Finalmente, se determinó el efecto fisiológico de NPQ mediante la medición de la expresión de los genes activados por respuestas defensiva tempranas a quitina CERK1, STZ, ATL y MAPK3, y la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en plántulas de N. benthamiana de 20 días tratadas por 1 hora con NPQ. Se determinó que las NPQ poseen un tamaño promedio de 280 nm de diámetro ± 12,88 nm, una polidispersidad de 0,229 ± 0,021 y una carga de 26,9 mV ±1,06 mV. Además, se corroboró que están conformadas por quitina debido a la desaparición de microagregados formados por las NPQ luego de su digestión enzimática con quitinasas al ser observados bajo microscopía de contraste de fases. Al determinar el movimiento de la NPQ al interior de las plántulas, se logró observar fluorescencia asociada a FITC solo en la raíz primaria de plántulas tratadas en hojas, concentrada en el interior de la raíz y adyacente a la superficie del tejido. Por otro lado, al aplicar NPQ marcadas con FITC en raíz no se encontró fluorescencia asociada a FITC en la hoja, pero si existió interacción de las NPQ con la raíz en forma de pequeñas aglomeraciones superficiales. Finalmente, se determinó un aumento en la producción de ROS en plántulas tratadas con NPQ y un aumento de la expresión de los genes analizados, excepto para gen CERK1 que disminuyó su expresión. Estos resultados demuestran la capacidad de generar NPQ mediante emulsión, las cuales son capaces de ingresar a través de hojas en plántulas de N. benthamiana, diseminarse en su interior y activar respuestas de defensa temprana.