Tesis Doctorado
Caracterización estructural y estudio de la especificidad de sustrato de vpaat1: una enzima alcohol aciltransferasa asociada a la biósíntesis de compuestos volátiles en vasconcellea pubescens.
Autor
Morales-Quintana, Luis Alberto
Institución
Resumen
En Vasconcellea pubescens (papaya cultivada en Chile) el aroma del fruto es
atribuido principalmente a ésteres de bajo peso molecular, los cuales son el resultado de las
reacciones de esterificación entre alcoholes y derivados de acil-CoAs mediante la acción de
la enzima alcohol aciltransferasas (AAT). Las enzimas AATs han sido agrupadas dentro de
la superfamilia llamada BAHD. Los miembros de esta superfamilia poseen una elevada
divergencia de secuencia. A pesar de esto, comparten motivos conservados como el motivo
HxxxD, localizado en la región media de cada enzima, y que está asociado a la actividad
catalítica de la enzima, y el motivo DFGWG, localizado en el extremo carboxilo terminal
de la proteína y sin un rol del todo claro a la fecha de inicio del trabajo de tesis doctoral.
Estudios previos realizados en V. pubescens han permitido aislar y caracterizar el gen que
codifica para la enzima VpAAT1 pudiendo comprobar que posee estos motivos
conservados, además se pudo establecer que la proteína es capaz de aceptar un amplio
rango de sustratos tipo alcoholes y acetil-CoA como sustrato dador del grupo acilo
produciendo distintos ésteres. Adicionalmente, mediante modelamiento comparativo se
obtuvo una aproximación de la estructura tridimensional de la enzima VpAAT1 la cual
mostró al motivo HxxxD expuesto al canal de solvente en el centro de la estructura formada
entre los dos dominios principales. Mientras que el motivo DFGWG fue expuesto en la
superficie de la proteína lejano de la zona del canal de solvente a una distancia superior a
20 Å.
Sin embargo, y a pesar del conocimiento generado en los últimos años, todavía existe
una comprensión limitada de los mecanismos que controlan la síntesis de compuestos
volátiles en estos sistemas enzimáticos. Por esta razón, se propuso esta trabajo de tesis, con
el objeto de aumentar nuestro entendimiento acerca de este proceso en los frutos de papaya
que se cultivan en Chile (V. pubescens).
Se realizó el estudio sobre el mecanismo de acción de la enzima y el rol de los
residuos del motivo HxxxD, estudios cinéticos y de mutaciones sitio dirigidas. Basados en
los estudios de inhibición, el mecanismo cinético de VpAAT1 podría describirse en
términos de un mecanismo complejo ternario en el que ambos sustratos y la enzima forman
un complejo para que la catálisis pueda ocurrir. Se evaluaron las sustituciones de H166A, D170A, D170N y D170E in silico.
Mediante esta estrategia se encontraron las principales diferencias en la forma y el tamaño
de las distintas estructuras de los canales de solvente en los modelos de las proteínas
mutantes. Esto fue concordante con energías de afinidad desfavorables para la interacción
de las proteínas mutantes con diferentes alcoholes y derivados de acil-CoAs como
sustratos. Lo anterior ocurre producto de un mal posicionamiento de los sustratos al interior
de los canales de solvente. Mutaciones in vitro sobre los residuos H166 y D170 mostraron
una pérdida de actividad en las enzimas VpAAT1-mutantes, lo que confirmó el papel
funcional de los residuos durante la catálisis.
Estudios sobre los residuos D38, R294 y S370, los cuales son conservados entre los
miembros de la superfamilia y que se encontrarían presentes en el canal de solvente,
mostraron que los residuos D38 y R294 estarían implicados en la estabilidad de las entradas
del canal de solvente y modificaciones de estos residuos implicarían una pérdida de la
estabilidad del canal de solvente, mientras que el residuo S370 tendría un rol en la
reorientación del sustrato alcohol desde el residuo D170 hacia el residuo H166.
Adicionalmente, con respecto a los estudios in silico realizados sobre el residuo D381
del motivo DFGWG, mostraron que la sustitución D381A generaría pequeñas
perturbaciones sobre la estructura de la enzima, lo que se traduciría en una pérdida de la
integridad de la cara frontal del canal de solvente. Esto concuerda con lo descrito hasta la
fecha, acerca de que este motivo (DFGWG) efectivamente tendría un rol estructural para la
enzima. Finalmente, los estudios presentados en este trabajo de tesis doctoral representan
una aproximación teórica de los eventos estructurales que podrían ocurrir naturalmente en
la enzima al llevar a cabo las mutaciones de manera in vitro, permitiendo planear y ejecutar
de mejor manera las investigaciones y actividades futuras. PFCHA-Becas Doctorado en Ciencias Mención Ingeniería Genética Vegetal 181p. PFCHA-Becas TERMINADA