Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular)"La transformación maligna del epitelio cervicouterino es causada por infección persistente de virus del papiloma humano (VPH) que expresan los oncogenes virales E6 y E7. El gen viral E2 codifica un represor de los oncogenes E6 y E7 y usualmente se interrumpe durante la integración del genoma viral, con la consecuente pérdida de su actividad represora que resulta en sobreexpresión persistente de los oncogenes que inician la transformación neoplásica y provocan la progresión tumoral. La integración del genoma viral es más frecuente en las lesiones neoplásicas de alto grado y constituye un marcador de progresión tumoral. La determinación del estado físico del genoma viral puede hacerse por PCR en tiempo real (TR) mediante la relación del número de copias de los genes E2 y E6, ya que el primero usualmente es eliminado durante la integración del genoma viral al genoma celular. Con el fluorocromo SYBRGreen ha sido posible cuantificar las copias de los genes E2- y E6-VPH16 y correlacionar el cociente E2/E6 con el grado de la lesión neoplásica. En este trabajo aumentamos notablemente la sensibilidad de la PCR-TR para determinar el número de copias del gen E2 con un método de PCR-TR desarrollado en nuestro laboratorio en el cual preamplificamos con 15 ciclos mediante PCR convencional y luego llevamos a cabo PCR anidada en presencia de EvaGreen, fluorocromo más eficiente que SYBRGreen. Con este método hemos podido correlacionar el número de copias con el grado de las lesiones displásicas del cérvix; y esperamos pronto cuantificar simultáneamente los genes E2- y E6-VPH16 para determinar la integración del genoma viral. Nuestra estrategia incluyó la construcción del plásmido pEV201 con el inserto E2- VPH 16 de 1031 pb (E2-1031) amplificado a partir del genoma completo de VPH16, su clonación en Escherichia coli TOP 10 y su propagación y purificación para usarlo como control de calibración de las mezclas de PCR-TR. Los ensayos de PCR-TR se llevaron a cabo en dos etapas: 1) PCR1, mezclas de preamplificación convencional de E2-1031 por 15 ciclos a partir de 0.096 ngde DNA de pEV201 (2.1×107 copias) y 2) PCR2, mezclas con diluciones logarítmicas seriadas de PCR1 para amplificar el producto E2-177 por PCR-TR anidada en mezclas equivalentes a 2.1×103-2.1×107 copias de pEV201.""Malignant transformation of the uterine cervical epithelium is caused by persistent infection of human papillomavirus (HPV) expressing the E6 and E7 oncogenes. The viral E2 gene encodes a repressor of both oncogenes and is usually disrupted during integration of the viral to the cellular genome; the resulting repressor loss allows persistent overexpression of the oncogens which start neoplastic cell transformation and provokes tumor progression. Integration of the viral genome is more frequent in high degree neoplastic lesions and therefore constitutes a tumor progression marker. Determination of the physical status of the viral genome (i.e., integration) can be performed with real time (RT) PCR through the E2/E6 copy number ratio, since the E2 gene is usually deleted during integration. The SYBRGreen fluorochrome has been used to quantify HPV16 E2 and E6 genes and to correlate the E2/E6 ratio with the degree of cervical neoplastic lesions. In this work we have significantly increased the sensitivity of the E2 gene copy number quantitation by using a RT-PCR method recently developed in our laboratory which consists of 15 cycles of conventional PCR amplification followed by nested PCR-RT with EvaGreen, a fluorochrome more efficient than SYBRGreen. With this new method we confirmed the correlation between copy number and the degree of the cervical neoplastic lesion and expect soon to quantify the E2- and E6-VPH16 genes simultaneously to determine the viral genome integration in displastic cervical scrapings. Our experimental strategy included construction of pEV201, containing the E2-HPV16 1031 bp insert (E2- 1031) that had been amplified from pHPV16 (known to contain the complete HPV16 European reference genome); the construct was used to obtain cloned Escherichia coli TOP10 transformants from which it was propagated and purified as a calibration control. PCR-TR assays were performed in two steps: 1) PCR1, conventional direct PCR mixtures containing 2.1×107 copies (4.65 ng) of pEV201 DNA incubated 15 cycles to preamplify E2- 1031 and 2) PCR2, nested PCR-RT mixtures containing 1/50 volume of serial logarithmic dilutions of the PCR1 mixtures, equivalent to 2.1×104-2.1×107 initial copies of pEV201 to amplify E2-177. "