Characterization and genome analyses of Bdellovibrio strains isolated from different environmental sources in Reynosa, Tamaulipas, Mexico

Abstract

RESUMEN: Las especies del género Bdellovibrio corresponde a pequeñas bacterias Gram negativas de 0.2-0.5 μm × 0.5-2.5 μm, uniflageladas, móviles, atacan e hidrolizan los componentes celulares de otras bacterias Gram-negativas utilizando los nutrientes derivados del proceso de digestión para el crecimiento y la reproducción. Las características depredadoras de Bdellovibrio spp. las convierte en una herramienta de biocontrol útil en áreas como: medicina, acuicultura, ganadería, industria alimenticia y horticultura. Sin embargo, a pesar de las numerosas investigaciones sobre esta bacteria benéfica, hay una escasez de información sobre Bdellovibrio spp. en México. Por lo tanto, esta investigación se enfocó en el aislamiento, caracterización y análisis del genoma de cepas de Bdellovibrio provenientes de suelos y aguas residuales del municipio de Reynosa, Tamaulipas, México para entender el estilo de vida de Bdellovibrio spp. y emplearla como agente de biocontrol. Se aislaron cinco cepas de Bdellovibrio spp., presentes en muestras de suelo, mediante la técnica de cultivo dependiente y empleando a tres miembros de la familia Enterobacteriaceae (Klebsiella sp., Salmonella sp. y Citrobacter freundii ATCC 8090) como presa. Las cepas de Bdellovibrio aisladas son Gram-negativas, bacteriolíticas, formadoras de placas y altamente móviles. Las cepas de Bdellovibrio se identificaron y confirmaron mediante microscopía, amplificación por PCR del locus ‘hit’ y con secuenciación del gen 16S rRNA. Se determinó que eran diferentes cepas basadas el locus ‘hit’ y con el análisis de amplitud de presas. Toda esta información confirma las investigaciones anteriores que describen el comportamiento heterogéneo de las poblaciones de Bdellovibrio spp., por lo que es necesario identificar la diversidad de las cepas. El segundo objetivo de este estudio, se enfocó en aislar el fenotipo con crecimiento independiente de presa, “host independent”, de las cepas de Bdellovibrio utilizando tres métodos diferentes descritos en la literatura, sin embargo, no se aislaron con éxito. Así, las colonias bacterianas aisladas con estos métodos se asemejaban fenotípicamente a las cepas de Bdellovibrio con crecimiento independiente descritas en la literatura, pero resultaron negativas para la caracterización y confirmación por PCR del gen 16S rRNA y del locus ‘hit’. Este resultado interrumpió el estudio de las características bioquímicas de estas cepas. A través de la secuenciación del genoma completo y los estudios comparativos del mismo, se puede proporcionar información acerca de la naturaleza depredadora de Bdellovibrio spp, como su adaptación ecológica y, al mismo tiempo, ayudar con éxito en su uso como control biológico contra patógenos. Se secuenció el genoma de dos aislados independientes de Bdellovibrio spp. (SKB1291214 y SSB218315) mediante secuenciación de siguiente generación tipo Illumina. El genoma completo de B. bacteriovorus SSB218315 arrojó un tamaño de genoma de 3,769,537 pb y un contenido GC de 50.5%, mientras que el borrador final del genoma de Bdellovibrio spp. SKB1291214 tiene un tamaño de 3,724,490 pb, conformado por 20 contigs y un contenido GC del 44.8%. Los factores genéticos encontrados que pueden ayudar en la depredación de Bdellovibrio spp. se incluyen: el flagelo, pili tipo IV, quimiotaxis, factores asociados a toxinas y un buen número de enzimas degradativas. El análisis comparativo de genomas basado en la identidad de aminoácidos (AAI) y secuencia del gen 16S rRNA reveló la relación genómica entre las cepas del estudio y otros 7 genomas depositados en la base de datos NCBI. Las cepas de Bdellovibrio aisladas mostraron diferencias basadas en la secuencia del gen 16S rRNA con Bdellovibrio spp. compartiendo una similitud del 99% con una cepa no cultivable de Bdellovibrio sp. 12L 106 (distancia entre parejas de 0,008) y una identidad de 95-97% (distancia entre parejas de 0,043) con otras cepas cultivables de Bdellovibrio spp., incluyendo la cepa SSB218315. Bdellovibrio sp. SKB1291214 presentó un AAI bajo con otras cepas (63.7 – 67.68 %) mientras que B. bacteriovorus SSB218315 compartió una alta identidad de aminoácidos (95 %) con cepas de B. bacteriovorus HD100, Tiberius y 109J. Por lo tanto, tomando en cuenta el porcentaje de contenido de GC, el patrón de agrupación de árboles filogenéticos y el valor de AAI, la cepa SKB1291214 podría ser una nueva especie. Además, Bdellovibrio sp. SKB1291214 también poseyó 30 grupos de genes únicos, algunos de los cuales podrían haber sido adquiridos a través de la transferencia horizontal de genes. Además, las variaciones en la secuencia del gen Bd0108, el cual está relacionado a la adherencia, ataque e invasión de la presa, como el establecimiento del fenotipo de crecimiento independiente de presa observados en Bdellovibrio sp. SKB1291214 puede ser un factor responsable de la reducción de su capacidad depredadora en comparación con la cepa SSB218315. Estos estudios del genoma proporcionan información que puede ayudar a la aplicación de Bdellovibrio spp. como un agente de control biológico. ABSTRACT: Bdellovibrio spp. are small (0.2-0.5μm × 0.5-2.5μm), uniflagellated, motile Gram negative bacteria that attacks and hydrolyzes cellular constituents of other Gram-negative bacteria. They utilize the derived nutrients from the digestion process for growth and reproduction. The predatory characteristics of Bdellovibrio sp. makes them suitable as a biocontrol agent against different bacterial pathogens in different fields including medicine, aquaculture, animal husbandry, food industry, and horticulture. However, despite numerous publications and researches on this beneficial bacteria, there has been a paucity of information on Bdellovibrio spp. in Mexico. In an effort to understand the predatory lifestyle, and apply Bdellovibrio spp. as a biocontrol agent, we focus this research on the isolation, characterization and whole-genome analyses of Bdellovibrio strains isolated from soil and sewage in Reynosa, Tamaulipas, Mexico. In this study, five strains of Bdellovibrio were isolated from soil samples using the culture-dependent technique and three members of the family Enterobacteriaceae (Klebsiella sp., Salmonella sp., and Citrobacter freundii ATCC 8090) as prey. The Bdellovibrio strains were bacteriolytic, plaque-forming, and highly motile Gram-negative bacteria. We identified and confirmed the Bdellovibrio strains using microscopy, PCR amplification, and sequencing of the 16S rRNA gene. They were observed to be different strains based on hit locus and prey range analyses. Here, the first report on Bdellovibrio strains isolated from soil in Mexico corroborates earlier report indicating that populations of Bdellovibrio spp. are heterogeneous thereby the need to identify the various strains. In the second objective of this study, several attempts to culture the prey-independent phenotypes of the isolated Bdellovibrio strains using three different methods earlier described in literature was not successful. However, bacterial colonies isolated with this methods phenotypically resembled the prey-independent Bdellovibrio strains described in different publications but negative for characterization and confirmation based on PCR amplification of the 16S rRNA gene and hit locus. This result prevented us from studying the biochemical characteristics of these strains. An insight into the predatory nature of Bdellovibrio spp. through whole genome sequencing and comparative genome studies can provide information on their ecological adaptation and assist their successful application as a biocontrol agent against pathogens. We sequenced the genomes of two different Bdellovibrio spp. SKB1291214 and SSB218315 isolated from soil using Illumina Next Generation Sequencing technology. The complete genome of B. bacteriovorus SSB218315 yielded a genome size of 3,769,537 bp and GC content of 50.5 % while final draft genome of Bdellovibrio sp. SKB1291214 has a size of 3,724,490 bp, 20 contigs and GC content of 44.8 %. The factors found in the genomes that can aid predation in the Bdellovibrio spp. include flagellar, Type IV pilus, chemotaxis, toxin associated factors and quite numbers of degradative enzymes. Comparative genome analysis based on amino acid identity and 16S rRNA gene sequences revealed information on the genomic relatedness between the study strains and 7 other sequenced genomes retrieved from the NCBI database. The Bdellovibrio strains exhibited differences based on the 16S rRNA sequence with Bdellovibrio sp. SKB1291214 sharing 100 % similarity with an uncultured Bdellovibrio sp. clone 12L 106 (a pairwise distance of 0.008) and 95 - 97 % (a pairwise distance of 0.043) identity with other culturable terrestrial Bdellovibrio spp. including strain SSB218315. Bdellovibrio sp. SKB1291214 shared low AAI with other strains (63.7 – 67.68 %) while B. bacteriovorus SSB218315 shared high amino acid identity (95 %) with B. bacteriovorus strains HD100, Tiberius and 109J. Therefore, considering the percentage GC content, phylogenetic tree clustering pattern, and AAI value, strain SKB1291214 could be a novel species. Furthermore, Bdellovibrio sp. SKB1291214 also possessed 30 unique gene clusters, some of which might have been acquired through horizontal gene transfer. In addition, variations in the sequence of a Bd0108 gene, attributed to prey attachment, invasion, and development of prey-independent Bdellovibrio phenotypes observed in Bdellovibrio sp. SKB1291214 may be a contributory factor responsible for the reduction in its predatory capacity compared to strain SSB218315. This genome study provide information that can aid the successful application of Bdellovibrio spp. as a biocontrol agent.