Construcción y expresión recombinante de la proteína ns3 del virus del dengue serotipo 2 (cdenv) en Escherichia coli

Abstract

RESUMEN: El virus del dengue (DENV) es el agente causal más común transmitido por vectores en el mundo, causando entre 50-100 millones de infecciones y 25000 muertes por año. Es un arbovirus endémico de las regiones tropicales y sub-tropicales, y es transmitido por hembras virémicas de Aedes aegypti y A. albopictus. Una alternativa es por medio de vacunas o tratamientos antivirales, las cuales en la actualidad no se encuentran disponibles en el mercado. Recientemente, nuevos enfoques de control se han explorado, como es el desarrollo de fármacos dirigidos a proteínas blanco del virus, como la proteína viral no estructural 3 (NS3). Es una proteína multifuncional relacionada con actividades enzimáticas esenciales, como es la síntesis del ARN genómico e involucrada en el ciclo de replicación viral. El presente trabajo tuvo como objetivo construir la proteína recombinante his-tag NS3 del DENV-2 en un plásmido de expresión y determinar las condiciones óptimas para la sobre-expresión de la proteína en Escherichia coli. También modelar la estructura tridimensional de la proteína mediante estudios in silico. Adicionalmente se realizó la purificación de la proteína, flurometría, pruebas de dicroísmo circular y dinamismo molecular con la finalidad de buscar cambios en la estructura de la proteína. Para la construcción de la proteína recombinante his-tag NS3, se determinaron las condiciones óptimas de sobre-expresión y se utilizaron diversos plásmidos de expresión fusionados con una etiqueta de histidinas en la región N-terminal. Se probaron cinco cepas de E. coli en un rango de 37 a 20°C con diversos tiempos de inducción con IPTG. Para la identificación de la proteína recombinante his-tag NS3 se realizó Western Blot (WB) con Anti-His6. El estudio in silico, se llevó en el software Modeller 9.2 para comparar la proteína NS3 DENV-4 del Protein Data Bank (PDB) (2VBC) y el tipo 2. Finalmente se realizó un acoplamiento con ambas proteínas para evaluar la reproducibilidad del modelo en un ambiente biológico. La proteína recombinante his-tag se obtuvo en el plásmido pPROEX HT-a y en las células de expresión BL21(DE3) pLysS incubadas toda la noche a 20°C inducida con 1 mM de IPTG. La construcción de la proteína recombinante his-tag en el plásmido de pPROEX HT-a y células de expresión BL21(DE3) pLysS se incubaron toda la noche a 20°C induciendo con 1 mM de IPTG. Mediante los estudios in silico de la estructura tridimensional de las proteínas se logró un modelado comparativo probable entre la NS3 DENV-2 y 4, también se localizaron funciones esenciales y sitios blancos farmacológicos. Las pruebas por flurometría, indicaron la presencia de triptófanos y tirosinas poco expuestas en NS3. El Dicroísmo circular (DC) y el Dinamismo Molecular (DM) en solvente indicaron que la proteína recombinante adopta estructuras hélices α, hojas β y lazos. ABSTRACT: Dengue fever is one of the most common vector-borne viral diseases in the world, causing an estimated 50–100 million infections and 25,000 deaths each year. Is an endemic arbovirus from tropical and sub-tropical regions, and is transmitted by Aedes aegypti and Ae. albopictus infective females. An alternative to combat dengue disease is through vaccines or antiviral treatment but both remains not available in the market. Recently, new approaches to control have been explored such as drugs targeting specific dengue viral proteins, for example the NS3. The protein NS3 is a multifunctional protein related to essential enzymatic activities (protease and helicase). The principal objectives of this study were: firstly to construct the recombinant his-tag NS3 protein of dengue virus type 2 in an expression plasmid then to tested the optimal overexpression parameters in Escherichia coli, and finally modelate the tridimensional protein structure in silico. Additionally, protein purification, fluorometry to detect protein structural changes, circular dichroism and molecular dynamics were performed. To construct his-tag NS3 recombinant protein, three expression plasmids were used to make NS3 fusion with a histidine-tag at the N/terminal region. Five E. coli strains, five incubation times for induction with IPTG and different temperature ranged from 20 to 37°C were evaluated. Western Blot with Anti-His6 analyzes was used to confirm the his-tag NS3 protein construction. The in silico study was performed using the Modeller 9.12 software to compare the NS3 proteins of the dengue virus type 4 (from Protein Data Bank- 2VBC) and type 2. Finally, both proteins were docked in silico to evaluate the molecular design and biological protein behavior. The optimal condition for the recombinant protein his-tag -NS3 were obtained using the pPROEX HT-a plasmid and the BL21 (DE3) pLysS cells incubated overnight at 20°C with 1 mM of IPTG. The in silico studies of tridimensional structure of proteins allowed a comparative modeled between the NS3 of dengue virus type 2 and 4, and found a “hole site” with probability use to been a, pharmacological target for both proteins. The fluorometry bioassay indicated the presence of tryptophan and tyrosine in NS3 structure. The circular dichroism (CD) and molecular dynamics (MD) demonstrate that NS3 forms different secondary structures such as α-helix, β-sheet, and loops.