Evaluación del cultivo de Pichia pastoris para la producción de una proteasa recombinante JmCP4 de jacaratia mexicana

Abstract

RESUMEN:

La proteasas cisteínicas son enzimas utilizadas en el sector alimentario y en procesos de eliminación de proteínas porque son activas en un amplio intervalo de pH y de temperatura. La demanda de enzimas, en particular de proteasas para la industria alimentaria está en aumento. Sin embargo la disponibilidad en fuentes naturales como J. mexicana es limitada y con rendimientos reducidos, por lo que disponer de un sistema de expresión de proteínas recombinantes es indispensable. Una alternativa de producción constante de enzimas recombinantes, es por medio del cultivo de Pichia pastoris, el cual es un bioproceso dividido en dos etapas: una para la producción de biomasa y otra para la inducción de la enzima recombinante. En este trabajo: 1) se evaluaron las velocidades de crecimiento de las cepas de P. pastoris GS115 (14.6 g/L) y GS115-JmCP4 (15.4 g/L) durante la etapa de producción de biomasa, obteniéndose un valor de 0.216 h-1 y 0.213 h-1, respectivamente; 2) se evaluó el método de cultivo sobre la inducción de la proteasa recombinante (JmCP4) con metanol en medio BMMS observándose una velocidad de crecimiento de 0.022 h-1 y una producción de proteína extracelular total de 20.9 mg/L del zimógeno de JmCP4 a las 48 h. Por otro parte, en la etapa de inducción de la proteasa recombinante, se observó que la adición de histidina al medio de cultivo puede contribuir a la estabilidad de esta proteasa, posiblemente porque evita la proteólisis provocada por proteasas endógenas de P. pastoris. Además se realizó la caracterización bioquímica de la proteasa JmCP4, con un peso molecular de 23.6 kDa como proteína madura y 37.3 kDa como zimógeno, determinados por SDS-PAGE. El óptimo de actividad proteolítica sobre caseína se observó a 55°C y pH 9.5. Estos resultados sugieren que la proteasa JmCP4 podría competir con otras enzimas proteolíticas comerciales como la papaína (C. papaya).

ABSTRACT:

The cysteines proteases are enzymes used in the food industry or even in some other removal process because they are active in a wide range of pH and temperature. The commercial demand for these enzymes are increasing, however its exploitation from natural source as J. mexicana is limited with small yields. Therefore their availability for some others expressions recombinants systems is important. An alternative for constant production of recombinant proteases is by the Pichia pastoris culture, which is a bioprocess divided into two stages, one for biomass production and one more for the induction of the recombinant enzyme. In this study, we evaluated: 1) the growth rates of P. pastoris strains GS115 (14.6 g/L) and GS115-JmCP4 (15.4 g/L) in the biomass production stage with values of 0.216 h-1 and 0.213 h-1, respectively; 2) the culture method related to induction stage of the recombinant protease (JmCP4) with methanol in the medium BMMS. At this stage we observed a growth rate of 0.022 h-1 and the total production of extracellular protein was 20.9 mg/L as a zymogen of JmCP4 in 48 h. On the other hand, in the induction stage of JmCP4 protease, we observed that the addition of histidine to the culture medium may contribute to the stability of the protease, possibly it can avoid the proteolysis phenomenon caused by endogenous proteases of P. pastoris. The biochemical characterization of the JmCP4 protease had a molecular weight of 23.6 kDa as mature protein and 37.3 kDa as a zymogen. The optimal conditions for the proteolytic activity in casein were 55°C and pH 9.5. These properties of JmCP4 protease would allowed its industrial usage as papain (C. papaya).