Producción de la transposasa de TN5 en Escherichia coli BL21 para su funcionamiento in vitro

Abstract

RESUMEN:

Introducción. La transposición juega un papel importante en la evolución de los genomas y en una variedad de enfermedades genéticas, por lo que su estudio es de interés. Para su estudio es conveniente el uso de transposones bacterianos como lo es el Tn5. El transposón Tn5, es un elemento móvil de DNA. Tiene dos repetidos invertidos de 19 pb . Está compuesto por secuencias repetidas invertidas a los extremos, llamadas IS50L e IS50R flanqueando tres genes que codifican para la resistencia a kanamicina, bleomicina y estreptomicina. IS50R codifica una transposasa (Tnp) que cataliza todas las fases del proceso de transposición. La clave de la estructura molecular de todos los pasos de la transposición del Tn5 es un complejo dimérico sináptico de la transposasa con los extremos repetidos invertidos de la secuencia de DNA (2). Tn5 puede ser utilizado como una herramienta molecular ya que tiene tres características clave en su sistema. Primero una amplia variedad de mutaciones pueden ser generadas a partir del Tn5. Segundo, las estrategias de mutagénesis son técnicamente muy simples. Tercero, la tecnología es flexible especialmente con respecto a el DNA encontrado adentro de la secuencia del transposón (2). Metodología. Se usó el programa Gene Construction Kit™ versión 2.5.13, (Textco, Inc. 2002) para diseñar los iniciadores para la amplificación del gen tnp. Se utilizó el protocolo descrito por el proveedor para la enzima Pfx Platinum para la amplificación del gen tnp. Se construyó el plásmido pMMCYB111 a partir de pTYB11 y pMMC1957, obteniendo pMMC1958 y pTYB1136 que posteriormente se cortaron y ligaron para obtener la construcción deseada pMMCYB111. Los plásmidos se purificaron siguiendo la técnica de Birnboim y Doly con modificaciones y adaptaciones. Para la preparación de células competentes y la transformación de E. coli, se utilizó una técnica basada en el uso de CaCl2. Se utilizó el sistema IMPACT™ CN System de New England Biolabs para lograr la expresión y purificación de las proteínas. La cepa de E. coli BL21 fué transformada con el plásmido pMMCYB111 y se expresó la proteína híbrida inteína-transposasa llevando a cabo cinéticas de expresión y de densidad celular, posteriormente se purificó y separó la transposasa siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, EUA). Las muestras fueron tratadas y se corrieron en geles SDS-PAGE para determinar la expresión de la proteína. Resultados y discusión. Se cambiaron tres aminoácidos por medio de la amplificación por PCR con los oligonucleótidos diseñados para introducir las mutaciones en el gen, donde se cambia Glu54 por Lis con los oligos C1 y C2; Met56 por Ala con los oligos C3 y C4; y Leu372 por Pro con los oligos C5 y C6. Para la obtención del plásmido pMMCYB111 se ligaron los plásmidos pMMC1958 y pTYB11C36. Se realizó un corte del plásmido con las enzimas de restricción StuI y EcoRI para liberar el gen mutado de la transposasa que posteriormente fue secuenciado. Para la purificación se tomó en cuenta el protocolo seguido por Goryshin y Reznikoff y se establecieron nuevas condiciones para la expresión con la cepa BL21 de E.coli. La Figura 1 muestra la purificación de la transposasa y de la inteína como testigo. Los carriles 5, 6 y 7 pertenecen a la transposasa, donde se esperaría observar una banda intensa en el carril 6 que indicaría la purificación de la enzima y en el carril 7 la unión de la inteína a las perlitas de quitina. Dado a que no se observó ninguna banda en los carriles mencionados se vió que la transposasa y la inteína no se están expresando a partir del vector pMMCYB111. Los carriles 8,9 y 10 corresponden al plásmido pTYB11, donde sólo se purifica a la inteína. El carril 10 muestra la inteína unida a las perlitas de unión a quitina, donde se observa la banda intensa de inteína como se esperaría en los carriles correspondientes a la transposasa. Figura 1. Purificación de las proteínas. Carriles: 1,2 y 3 concentraciones de BSA conocidas 0.1, 0.2 y 0.5 μg/ml respectivamente. 4 marcador de tamaño molecular. 5 último lavado de la purificación antes de poner el buffer de elución. 6 clarificado de la purificación con la transposasa (con el buffer de elución). 7 perlitas de unión a quitina con la inteína. 8 ultimo lavado de la purificación antes de poner el buffer de elución (testigo inteína de pTYB11). 9 extracto clarificado de la purificación. 10 perlitas de unión a quitina con la inteína. Conclusiones y perspectivas. El gen de la transposasa fué mutado y amplificado. Se obtuvo el plásmido pMMCYB111 que contiene el gen tnp unido cotraduccionalmente a la inteína. Se secuenció el gen tnp mutado. Se establecieron las mejores condiciones para la expresión y purificación de la transposasa. Se realizaron cinéticas de expresión y purificaciones de la transposasa y de la inteína como testigo. Se observó que la proteína de interés no se expresa de una manera eficiente en el vector diseñado comparado con la expresión de la inteína en el plásmido pTYB11, por lo que el sistema diseñado es ineficiente y debe ser rediseñado.