Tesis
Determinación de parámetrois cinéticos de la catividad de fosfatasa áscida de Actinobacillus pleuropneumoniae
Fecha
2017-10-04Autor
Orozco Solis, Jenny Berenice
Institución
Resumen
DETERMINACIÓN DE PARAMETROS CINÉTICOS DE LA ACTIVIDAD DE FOSFATASA ÁCIDA DE
ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIA
JENNY BERENICE OROZCO SOLIS, * M. en C. RODRIGO MARTINEZ ZUÑIGA
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA. Av. Acueducto s/n, Col. Barrio la Laguna
Ticomán C.P. 07340 México, D.F. Tel. 57296000 Ext. 56318 y 56320 fax 56305 Mail.
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Palabras clave:.Actinobacillus pleuropneumoniae (Ap),Pleuroneumonía Contagiosa Porcina(PCP)
Introducción. La producción y consumo de carne de cerdo es
de gran importancia nacional. La industria porcícola se ve
afectada económicamente por una gran variedad de
enfermedades que puede contraer el cerdo. El Actinobacillus
pleuropneumoniae es un cocobacilo gramnegativo de la familia
Pasteurellaceae, es anaerobio facultativo. Las enzimas son en
general proteínas altamente especializadas, son catalizadores
muy potentes y eficaces, capaces de acelerar la velocidad de
reacción de la célula, químicamente son proteínas, se clasifican
en: Oxidorreductasas, Transferasas, Hidrolasas, Isomerasas,
Liasas, Ligasas. Las fosfatasas ácidas son producidas por
bacterias, hongos, levaduras, entre otros, presentan actividad
óptima a pH bajo, se localizan en lisosomas, algunas fosfatasa
ácidas están asociadas a la membrana celular en otros casos
están secretadas al medio de cultivo, el sustrato utilizado a nivel
laboratorio es p-nitrofenilfosfato (p-NPP), este puede actuar de
manera especifica y no específica, depende de la reacción en la
célula. Hay una serie de factores que se deben de tomar en
cuenta cuando se estudia la cinética de una reacción enzimática
entre los cuáles tenemos: Temperatura, pH, Efecto de la
concentración de sustrato, Efecto de inhibidores. Se debe
establecer las condiciones óptimas en todos los factores para
tener el máximo rendimiento en la actividad enzimática.
Metodología. Cepas y cultivos bacterianos. Se emplean para la
cepa de A. pleuropneumoniae, que crezca en medio Luria
Bertani con glucosa (LBG) líquido o Infusión Cerebro Corazón
(BHI) y mantener la cepa en el mismo agar del medio; en
cualquier caso el medio es suplementado con NAD. Emplear
cultivos de toda la noche, realizar Lavado de células;
Centrifugar, recuperar la pastilla y resuspender con
amortiguador., empleando Desoxicolato de Sodio. Se mide la
actividad y se determina la cantidad de proteínas presentes. Y
por ultimo medir. :Efecto de Temperatura, Efecto de pH,
Determinación de Km y Vmax, Efecto de inhibidores.
Resultados y discusión. Se logro determinar actividad
enzimática y cuantificación de proteínas .Se determinaron
parámetros cinéticos de la actividad de fosfatasa ácida
Gráfica1 Efecto de pH,
En la Gráfica 1 se observa la presencia de 2 picos de actividad a
pH ácido entre 5 y 6 muestra que nuestra enzima tiene límites de
pH óptimo no muy estrechos, mientras que en el lado alcalino se
observa actividad entre pH 7.5 y 8 esto nos indica que tenemos
la presencia de mas de una fosfatasa, sin embargo nuestro
extracto está enriquecido en fosfatasas ácidas.
Gráfica 2. EDTA
En la gráfica 2 se observa que el EDTA disminuye la actividad
de la enzima, conforme se aumenta la concentración del mismo
se puede ver que la actividad disminuye en un 50% con
aproximadamente 15mM de EDTA., la enzima requiere la
presencia de algún Ion metálico.
Conclusiones. De acuerdo ala manipulación que se tuvo con el
Actinobacillus pleuropneumoniae, podemos decir que es una
bacteria muy sensible, es por eso que se recomienda que se
debe de resembrar cada 10 días.
La temperatura óptima para la actividad de la enzima fue de
37ºC.
Al someter la enzima a 10 minutos de calentamiento a 38ºC
inicia un proceso de desnaturalización, la cual alcanza su
máximo al calentar a 48 ºC.
Para la determinación del pH óptimo se encontró que este ocurre
entre 5 a 6.
Los valores obtenidos de Vmax= 2.29 mM/ml y se pudo obtener
la Km= 1.031mM
La enzima requiere algún ión metáLa enzima no fue sensible a
Tartrato y muy poco sensible a Molibdato
La enzima es sensible a la inhibición por retroalimentación.
Perspectivas. Determinar si la molécula tiene un papel esencial
en el metabolismo de la bacteria. Determinar la funcionalidad de
la enzima en la bacteria. Realizar estudios de patogenicidad de
la enzima en la bacteria.
Agradecimientos. Al Instituto Polit la Unidad Profesional
Interdisciplinaria deBiotecnología, al Departamento de
Bioquímica, al M. en C. Rodrigo Martinez Zúñiga.
Referencias.
1. Fenwick B. (1994). Porcine Pleuropneumonia, JAVMA 204:
1334-1340
2. Lehninger, A.; “Bioquimica”, 2da. Edición, Ed. Omega,
Barcelona. 1978, pág 189 – 222.