Tesis
Efecto de la germinación sobre las propiedades anticancerosas de la proteína de soya
Fecha
23/08/2012Registro en:
Robles Ramírez, María del Carmen. (2010). Efecto de la germinación sobre las propiedades anticancerosas de la proteína de soya. (Doctorado en Ciencias en Alimentos). Instituto Politécnico Nacional, Sección de Estudios de Posgrado e Investigación, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, México.
Autor
Robles Ramírez, María del Carmen
Institución
Resumen
ABSTRACT: Extensive epidemiological, in vitro, and animal data suggest that soybean consumption reduces the risk of developing several types of cancer. The aim of this work was to investigate if germination improves the anticancer properties of soybean protein through generation of bioactive peptides and/or the modification of the amino acid composition. Soy protein isolates were obtained from soy germinated for 0-6 days. Germination induced the increase in the content of proteins, lipids, total phenolic compounds, isoflavones and saponins, as well as the content of hydrophobic amino acids and aspartic acid, but a decrease in arginine and lysine. The electrophoretic pattern of protein isolates showed that germination induced degradation of the α and α’ fractions of β-conglycinin and acid fraction of glycinin, from the third day of germination. Isolates with and without ethanol-soluble phytochemicals were hydrolyzed with digestive enzymes and their effect on growth in HeLa and C-33 (epidermoid cervical carcinoma) and HaCaT (non-cancerous human keratinocytes) cells was evaluated with the Alamar Blue and neutral red methods. The hydrolysates inhibited growth of the HeLa and C-33 cells depending on concentration but their effect on normal cells was minimal. Optimum inhibition was observed with the soybean hydrolysate germinated for two days and containing ethanol-soluble phytochemicals (IC50 = 2.14 mg/ml). Among the hydrolysates without ethanol-soluble phytochemicals that from soy germinated for six days exhibited maximum inhibition (IC50 de 4.02 mg/ml). A peptide fraction (AF) obtained by ultrafiltration of this hydrolysate was the most active; its electrophoretic profile revealed three major bands of 6, 11 and 21 kDa. This peptide fraction induced decreased expression of the genes TOP2A and PTTG1 (two genes considered as therapeutic targets) and consequently caused the apoptosis of cancer cells, via both the extrinsic and intrinsic routes activating the caspase cascade and causing DNA fragmentation. LC-MS/MS (liquid chromatography-mass spectrometry) analysis of AF showed that the bioactive peptide might be the leginsulin, a peptide involved in signal transduction of soybean cells. The in vivo assay showed that the protein of soy germinated for two days inhibits tumor growth by 98% causing cancer cells death by both necrosis and apoptosis. This is the first study that reveals that germination can enhance the anticancer effect of soy protein. Germinated soybean protein could be used as an ingredient in functional foods. RESUMEN: Numerosos datos epidemiológicos, y de estudios in vitro e in vivo, sugieren que el consumo de soya reduce el riesgo de desarrollar varios tipos de cáncer. El objetivo de este trabajo fue investigar si la germinación puede mejorar las propiedades anticancerosas de la proteína de soya a través de la generación de péptidos bioactivos y/o la modificación en la composición de aminoácidos. Para tal fin primero se obtuvieron y caracterizaron los aislados proteínicos de semillas de soya germinadas durante 0 a 6 días, encontrando que la germinación indujo un aumento en el contenido de proteínas, lípidos, compuestos fenólicos totales, isoflavonas y saponinas, así como en el contenido de aminoácidos hidrofóbicos y de ácido aspártico, pero una disminución en arginina y lisina. El perfil electroforético de los aislados reveló la degradación gradual de las fracciones ? y ?’ de la ?-conglicinina, y de la fracción ácida de la glicinina, a partir del tercer día de germinación. Los aislados completos y los extraídos previamente con etanol acuoso se hidrolizaron con enzimas digestivas y se evaluó su efecto sobre el crecimiento de células HeLa y C-33 de cáncer cérvico uterino y sobre células no cancerosas (HaCat) por los métodos de azul alamar y rojo neutro. Los hidrolizados inhibieron el crecimiento de las células cancerosas de una manera dependiente de la concentración siendo mínimo su efecto sobre las células normales. El hidrolizado de proteína de soya germinada durante 2 días, no extraído con etanol, fue el que mostró mayor efecto citotóxico (IC50 de 2.15 mg/ml). Entre los hidrolizados libres de fitoquímicos solubles en etanol el de 6 días fue el mejor con un IC50 de 4.02 mg/ml. Una fracción peptídica (FA), obtenida por ultrafiltración de este hidrolizado, fue la más activa y su perfil electroforético reveló tres bandas principales de 6, 11 y 21 kDa. Esta fracción indujo la disminución de la expresión de los genes TOP2A y PTTG1 (dos genes considerados como blancos terapéuticos) y como consecuencia provocó la apoptosis de las células cancerosas, tanto por la vía extrínseca como por la intrínseca, activando la cascada de caspasas y produciendo fragmentación del DNA. El análisis por LC-MS/MS de FA mostró que el péptido bioactivo podría ser la leginsulina, un péptido involucrado en la transducción de señales de las células de la soya. El ensayo in vivo mostró que la proteína de soya germinada inhibe el crecimiento del tumor hasta en un 98% provocando la muerte de las células cancerosas tanto por necrosis como por apoptosis. Este es el primer trabajo que revela que la germinación puede mejorar el efecto anticanceroso de la proteína de soya. La proteína de soya germinada durante 2 días podría utilizarse como ingrediente de alimentos funcionales.