Tesis
Transfección genética in vivo en presencia de fármacos que modifican la lipofección
Fecha
23/04/2012Registro en:
Serna Velázquez, Juan Manuel. (2010). Transfección genética in vivo en presencia de fármacos que modifican la lipofección. (Maestría en Biomedicina y Biotecnología Molecular). Instituto Politécnico Nacional, Sección de Estudios de Posgrado e Investigación, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, México.
Autor
Serna Velázquez, Juan Manuel
Institución
Resumen
RESUMEN: La terapia génica se define como el conjunto de metodologías que permiten llevar secuencias de DNA o de RNA al interior de células específicas, con el objetivo de modificar el curso de una enfermedad. La terapia génica requiere de metodologías de biología molecular e ingeniería genética para diseñar, transportar y liberar ácidos nucleicos, que contengan las secuencias necesarias para funcionar como genes terapéuticos en células específicas de un organismo. Una de ellas es la lipofección, la cual usa liposomas catiónicos que forman complejos con el DNA conocidos como lipocomplejos. Los lipocomplejos penetran a las células porque se fusionan con la membrana o por endocitosis y vacían su contenido en el citoplasma. Los liposomas catiónicos, como los formados con el lípido comercial LipofectaminaTM, son más eficientes en transferir genes a células en cultivo y en animales de experimentación que los liposomas neutros y aniónicos. Sin embargo, la reproducibilidad y eficiencia de la transfección genética que se ha obtenido con los complejos Lipofectamina-DNA es en general baja (?25%), lo que representa una limitante para aplicar la LipofectaminaTM en protocolos para terapia génica en el humano. Por lo que en este trabajo se usó el lisosomotrópico cloroquina, y la mezcla de este agente con dos fármacos que promueven la fusión de membranas, la cloropromacina y la procainamida, para mejorar la eficiencia y la reproducibilidad de la transfección genética in vivo de ratones BALB/c con lipocomplejos de Lipofectamina-pIRES2-EGFP. Para los experimentos de transfección se utilizaron las concentraciones de los fármacos que produjeron un mayor aumento en la transfección genética y además permitieron una viabilidad mayor al 80% en cultivos celulares HEK 293 y C-33 A. La transfección genética con lipocomplejos de Lipofectamina-pIRES2-EGFP en el bazo aumentó 5.1 veces y en el hígado 3.9 veces en presencia del lisosomotrópico cloroquina lo que sugiere que los lipocomplejos penetraron en ambos órganos por endocitosis. Posiblemente, la inactivación de las enzimas hidrolíticas de los fagolisosomas por el aumento del pH causado por la cloroquina, evitó la degradación de los lipocomplejos; además, el efecto de desestabilización de la membrana de los fagolisosomas que induce la acumulación de la cloroquina protonada permitió la liberación de los lipocomplejos hacia el citoplasma y, posteriormente se llevó a cabo la expresión genética del pIRES2-EGFP que contienen en el núcleo celular. Sin embargo, el mayor aumento en la transfección se obtuvo con la adición simultánea del lisosomotrópico con los fusionadores de membrana (6.0 veces en el bazo y 4.4 veces en el hígado para la mezcla cloroquina + procainamida y 6.5 veces en el bazo y 4.5 veces en el hígado para la mezcla cloroquina + cloropromacina), este aumento puede atribuirse a la combinación de los efectos de fusión de membranas y de inhibición de las enzimas lisosomales. Como se ha indicado, la procainamida y la cloropromacina inducen la formación de partículas lipídicas que intervienen en la fusión de membranas, por lo que se promueve la internalización de lipocomplejos vía endosomas; adicionalmente, la cloroquina al incrementar el pH del fagolisosoma, inhibe sus enzimas y desestabiliza su membrana, lo que permite que se liberen los lipocomplejos al citoplasma, que al alcanzar el núcleo expresan su información genética. Estos hallazgos han demostrado que la combinación adecuada de compuestos que tienen propiedades de favorecer la fusión membranal y de inhibir las enzimas hidrolíticas y de desestabilizar a los fagolisosomas, aumentan de forma muy importante la eficiencia de la transfección genética con lipocomplejos de LipofectaminaTM y DNA plasmídico pIRES2-EGFP en ratones BALB/c, lo que pudiera permitir en un futuro, su aplicación en protocolos de terapia génica en humanos.