Búsqueda de marcadores de islas de patogenicidad en cepas de Aeromonas spp. de origen clínico y ambiental

Abstract

ABSTRACT: Aeromonas is a genus that contains Gram-negative rod shaped facultative anaerobic bacterias. They are widely distributed through nature and are considered as important fish pathogens and other cold and warm-blooded animals. For several years, the significance of this genus as a human diarrhea-causing agent was controversial; some studies demonstrated that the pathogenic mechanism of Aeromonas species is multifactorial because of many virulence factors are involved. Previously, we described the presence of a Pathogenicity Island (cagA and cagE) from Helicobacter pylori in Aeromonas spp. and demonstrated its horizontal transfer between the genera. The aim of this study was to investigate the presence of pathogenicity islands in environmental and clinical strains of Aeromonas spp. isolated in Mexico. This study includes 63 clinical isolates form Hidalgo, 41 strains of environmental origin and 14 reference strains of Aeromonas spp, and H. pylori ATCC 43504, Haemophilus influenzae ATCC 33930 and E. coli J53 strains with pFBAOT6 plasmid were used as a positive control. E. coli K12 strain was used as a negative control. The presence of tfc16 ATPases (H. influenzae) and cagE (H. pylori) was determinated by PCR using the primers proposed by Ikenoue and Espinoza-Mellado in 2001 and 2009 respectively. The amplicons of the tfc16 gene (277 bp) and cagE (350 bp) from reference strains and the A. bestiarum AhA4 strain were purified using Pure Link kit (Invitrogen) and sequenced with the ABIPRISM 3100, the consensus sequence was analyzed in the program NCBI-BLAST. Specific primers were designed for amplification of virB2, virB9 and virB11 genes of type IV secretion system with plasmid sequences of Aeromonas spp. and a multiplex PCR standardized. The amplicons obtained was sequenced and analyzed using bioinformatics with the same strategy as the previous genes. A total of 23/41 from environmental strains showed an amplicon of 350 bp for the cagE gene by PCR. BLASTn analysis showed a 78% similarity to the cagE gene of A. bestiarum AhA4. 63 clinical isolates of the state of Hidalgo and 10 reference strains of Aeromonas spp. didn’t present the cagE gene. For tfc16 gene, 14/41 strains of environmental origin showed an amplicon of 277 bp its similarity was of 100% from the same gene reported in the genomic island of H. influenzae. The multiplex PCR with 3 marker genes virB2 of 114 bp, virB9 of 278 bp and 200 bp virB11 was standardized using the primers designed by the program Primer 3 and DNAM v 3.0. With this technique we determined that 14/56, 56/104 and 67/104 strains from environmental sources and clinical Aeromonas spp posses the virB2, virB9 and virB11 genes, respectively. Finally, we selected 8 strains of environmental origin and 3 of clinical origin for future studies of the presence of pathogenicity islands in the genus Aeromonas. In conclusion the presence of cagA and cagE genes in Aeromonas spp. could be an indicator of pathogenicity islands in this genus and recombination processes between these and H. pylori genera.

RESUMEN: El género Aeromonas se asocia a enfermedades gastrointestinales y extraintestinales, con alta incidencia en el medio ambiente. El mecanismo de patogenicidad se considera multifactorial abarcando toxinas y sistemas de secreción tipo II, III, IV y VI. Sin embargo, éste no se encuentra totalmente elucidado. Se ha descrito la presencia de los genes marcadores de la isla de patogenicidad de Helicobacter pylori como cagA y cagE en cepas ambientales de Aeromonas spp. los cuales fueron transferidos horizontalmente. El objetivo del presente trabajo fue investigar la presencia de islas de patogenicidad en cepas de Aeromonas spp. de origen ambiental y clínico aisladas en México. En este estudio, se incluyeron 63 aislamientos clínicos del estado de Hidalgo, 41 cepas de origen ambiental y 14 cepas de referencia de Aeromonas spp. Para todos los ensayos moleculares se utilizó como control positivo la cepa de H. pylori ATCC 43504, Haemophilus influenzae ATCC 33930 y E. coli J53 con el plásmido pFBAOT6, y como testigo negativo la cepa de E. coli K12. Se determinó la presencia de las ATPasas tfc16 (H. influenzae) y cagE (H. pylori) mediante PCR utilizando los iniciadores propuestos por Ikenoue y cols. y por Espinoza respectivamente. Los amplicones de los genes tfc16 (277 pb) y cagE (350 pb) de las cepas de referencia y de la cepa A. bestiarum AhA4 se purificaron mediante el kit Pure Link (Invitrogen) y se secuenciaron con el sistema ABI PRISM 3100, la secuencia consenso se analizó en el programa BLAST del NCBI. Se diseñaron iniciadores específicos para la amplificación de los genes virB2, virB9 y virB11 del sistema de secreción tipo IV con secuencias plasmídicas de Aeromonas spp. y se estandarizó una PCR múltiple. Los amplicones obtenidos fueron secuenciados y analizados bioinformáticamente usando la misma estrategia que con los genes anteriores. Empleando la PCR se determinó que 23/41 cepas ambientales presentaban un amplicón de 350 pb correspondiente al gen cagE. El resultado del BLAST de la secuencia consenso de la cepa A. bestiarum AhA4 presentó 78% de similitud para el gen cagE. Los 63 aislamientos clínicos del estado de Hidalgo y las 10 cepas de referencia de Aeromonas spp. no presentaron el gen cagE. Para el gen tfc16 14/41 cepas de origen ambiental presentaron un amplicón de 277 pb cuya similitud es del 100% con respecto al mismo gen reportado en la isla genómica de H. influenzae. El diseño de los iniciadores para los genes virB2, virB9 y virB11 obtenidos con el programa Primer 3 y DNAMAN v 3.0 no presentaron parámetros fisicoquímicos erróneos y son específicos, al realizar estudios “in silico” para secuencias de los plásmidos pRA3 y pFBAOT6 que codifican para SSTIV y resistencia a antibióticos en Aeromonas spp. Se estandarizó una PCR múltiple con 3 genes marcadores virB2 de 114 pb, virB9 de 278 pb y virB11 de 200 pb.Se determinó que 14/104 cepas de origen ambiental y clínico de Aeromonas spp. poseen el gen virB2, mientras que 56/104 presentan el gen virB9 y finalmente en 67/104 cepas se detectó el gen virB11. Se seleccionaron 8 cepas de origen ambiental y 3 de origen clínico que son candidatos para la búsqueda de una isla de patogenicidad y su posible caracterización en estudios posteriores. Debido a que los genes cagE y cagA se han identificado como marcadores de cag-PAI en H. pylori, su presencia en cepas ambientales de Aeromonas spp. podría ser indicativo de la presencia de islas de patogenicidad en este género.