Desarrollo de un sistema acarreador de antígenos mediante la expresión de un dominio de unión a biotina fisionado con el autotransportador ShdA en la superficie de salmonella entérica Serovar Typhimurium

Abstract

RESUMEN: Antecedentes. Los “acarreadores vivos” son bacterias atenuadas modificadas mediante ingeniería genética, que producen proteínas recombinantes heterólogas y constituyen un tipo de vacuna muy prometedor, pues se administran por vía oral y transportan antígenos pasajeros directamente hasta células dendríticas y macrófagos. Aunque han demostrado que son capaces de generar respuesta inmunológica efectiva contra diversos microorganismos en modelos animales, existen problemas técnicos que han dificultado su desarrollo y utilización en humanos. La producción de la proteína pasajera puede constituir una carga metabólica importante para la bacteria acarreadora y también existe la posibilidad de que le confiera propiedades que aumenten su patogenicidad. Por otro lado, la localización de las proteínas recombinantes en los diferentes compartimientos bacterianos puede influir en la eficiencia de la respuesta inmune, pues se sabe que la expresión de los antígenos pasajeros en la superficie favorece la producción de anticuerpos. En general, para lograr la expresión de antígenos en la superficie bacteriana, se requiere construir proteínas de fusión en flagelina, fimbria o proteínas de membrana externa o utilizar sistemas de transporte y excreción de proteínas propias de la bacteria. Sin embargo, la expresión de antígenos en la superficie es generalmente pobre y pueden no lograr un plegamiento análogo a la proteína nativa. Para solucionar estos problemas utilizamos un sistema ligando-receptor que permite “acoplar” antígenos de interés directamente a la superficie de vector bacteriano. Para ello, antígenos previamente biotinilados se conjugarán a avidina expresada en la superficie de Salmonella enterica serovar Typhimurium como una proteína de fusión al dominio β del autotransportador ShdA. Con ello, se evitarán métodos complejos de ingeniería genética y se cuenta con un acarreador universal que permite la evaluación rápida de candidatos a vacuna. Justificación. Existe la necesidad de mejorar las vacunas basadas en la estrategia de “vectores bacterianos”, de tal modo que se incremente la calidad y cantidad de proteínas pasajeras que produzcan, sin que constituyan una carga metabólica importante para la bacteria acarreadora y sin que se modifiquen sus propiedades biológicas. Para lograr una mejor respuesta de anticuerpos es conveniente que los antígenos pasajeros se expresen en la superficie bacteriana Planteamiento del problema. La producción de proteínas recombinantes en bacterias atenuadas puede ser ineficiente por diversas causas, tales como estabilidad de plásmidos, toxicidad o carga metabólica. Por otro lado, las proteínas recombinantes pueden conferir nuevas propiedades patogénicas a las bacterias transformadas. Consecuentemente, es necesario un sistema que asegure la estabilidad y seguridad de los acarreadores bacterianos. Hipótesis. El acarreador bacteriano Universal, expresara en la superficie de E.coli y Salmonella entérica serovar Typhimurium a la bandera molecular Flag y a la Avidina. Objetivos. Se desarrollo un acarreador bacteriano universal, consistente en una cepa de Salmonella enterica serovar Typhimurium SL3261 que expresa en su superficie a la avidina como una proteína de fusión al dominio beta del autotransportador ShdA. Material y métodos. El gene que codifica para la avidina se amplifico por PCR a partir del plásmido PAH3545, se insertará en el plásmido pENP01 y se transformo en Escherichia coli HB101. El gene de fusión resultante esta bajo el control del promotor inducible nirB, conteniendo la avidina, la porción translocadora del dominio α de ShdA, el dominio β de ShdA y la secuencia FLAG, que sirve como bandera molecular. La producción de la proteína de fusión Avidina-ShdA-Flag se evaluó mediante electroforesis en geles de acrilamida en condiciones reductoras y no reductoras (SDS-PAGE) e inmuno-electrotransferencia utilizando anticuerpos contra FLAG a partir de extractos crudos de proteína bacteriana. La translocación de la proteína de fusión a la superficie bacteriana se evaluó por inmunofluorescencia indirecta (IFA) y citometría de flujo. Y se transformo en Salmonella enterica serovar Typhimurium.

ABSTRACT: "Live acarreadores" are dimmed bacteria modified through genetic engineering, that produce recombinant heterologous proteins and are a very promising vaccine type given orally and take antigens passengers directly to macrophages and dendritic cells. Although they have shown they are capable of generating effective immune response against various microorganisms in animal models, there are technical problems that have hampered their development and use in humans. Transient protein production may constitute an important metabolic burden for the acarreadora bacteria and also the possibility of implying properties to increase its pathogenicity. On the other hand, the location of recombinant in different compartments bacterial proteins can affect efficiency of immune response, because you know the expression of antigens passengers on the surface favours the production of antibodies. Although the mechanism is unclear, this relates possibly accessibility to lymphocytes B, which allows a more efficient presentation of antigens passengers. In general, build protein flagellin, fimbria or outer membrane protein fusion or use own bacteria protein excretion and transport systems is required for the expression of antigens on the bacterial surface. However, the expression of antigens on the surface is generally poor and they can not achieve an analogous to the native protein folding. We use a system to solve these problems ligand-receptor allowing "flatten" Antigen of interest directly to the surface of bacterial vector. This new procedure allows lead peptides or complete proteins could adapt to the transport of non protein molecules and other biotechnological applications. To do this, previously biotinilados antigens conjugarán avidina expressed on the surface of salmonella enterica serovar Typhimurium as a protein fusion domain autotransportador ShdA β. This complex methods of genetic engineering can be avoided and there is a universal carrier that allows rapid evaluation of vaccine candidates. Justification. There is a need to improve vaccines based on the strategy of "bacterial vectors", so to increase the quality and quantity of temporary proteins that produce without constitute an important metabolic burden for the acarreadora bacteria and without modifying their biological properties. To achieve a better antibody response is appropriate passengers antigens are expressed on the bacterial surface. Approach to the problem. Production of recombinant dimmed bacterial proteins can be inefficient for various reasons, such as stability of plasmids, toxicity or metabolic burden. On the other hand, recombinant proteins can confer new pathogenic properties transformed bacteria. Consequently, a system to ensure stability and security of the bacterial acarreadores is required. Hypothesis. The bacterial carrier universal, expressed on the surface of e. coli and enteric Salmonella Typhimurium serovar molecular flag Flag and the Avidina. Objectives. Build a bacterial carrier universal, consisting of a strain of salmonella enterica serovar Typhimurium SL3261 expressing its surface to the avidina as a protein fusion to the beta of the ShdA autotransportador domain. Material y métodos. The gene that encodes for the avidina amplifico for PCR of the PAH3545, plasmid is inserted in the pENP01 plasmid and will be transformed into Escherichia coli HB101. The resulting fusion gene will be under the control of the inducible promoter nirB, containing the avidina, the translocadora ShdA α domain portion, the β ShdA and the stream FLAG, to serve as molecular flag domain. Production of Avidina-ShdA-Flag fusion protein will be evaluated through electrophoresis gels of acrylamide in conditions reducing and not reducing (SDS-PAGE) and immuno-electrotransferencia using antibodies against FLAG from crude extracts of bacterial protein, periplasm and outer membrane proteins. The translocation of the bacterial surface fusion protein will be evaluated by indirect immunofluorescence (IFA) and flow cytometry. Transformed salmonella enterica serovar Typhimurium.