Síntesis, caracterización y evaluación microbiológica de compuestos Espiro-B-Lactámicos

Abstract

RESUMEN: Con el descubrimiento de la penicilina, y su blanco biológico primario; la proteína de unión a penicilina (PBP´s) anclada en la membrana celular bacteriana y encargada del paso final de la biosíntesis de la pared celular, se determinó el modo de acción de estos fármacos. Sin embargo el uso indiscriminado de tales antibióticos β-lactámicos como penicilinas y cefalosporinas ha resultado en el incremento del número de cepas bacterianas resistentes a la quimioterapéutica actual por la producción de β-lactamasas. Como una estrategia a este mecanismo de resistencia de las bacterias, se han desarrollado nuevas moléculas con actividad sobre PBP´s y/o β-lactamasas. Una propuesta en este trabajo es la síntesis de espiro β-lactamas, para lo cual se utilizó la reacción de Staudinguer que consiste en una reacción de ciclo adición [2+2] entre una cetena y una imina. La síntesis de cuatro N-aril-espiro-β-lactamas sustituidas (3a-3d) se llevó a cabo mediante la adición de la cetena (2-Cloroetenona) generada in situ, a las correspondientes isomaleimidas a - 78ºC y bajo atmósfera de nitrógeno, con rendimientos mayores del 60% después de su purificación. Todos los compuestos obtenidos en la síntesis de estas espiro-β-lactamas se caracterizaron por espectroscopía de Infrarrojo (IR), espectroscopía de resonancia magnética nuclear de protón y carbono trece (RMN 1 H y 13C), así como, espectrometría de masas (GC-MS). Adicionalmente se corroboró la estructura de estos compuestos mediante un estudio de difracción de rayos X de la Naril-espiro-β-lactama 3c, observándose un arreglo casi coplanar entre el anillo β-lactámico y el anillo aromático de-51.80°. Para la optimización de la geometría del compuesto 3c se utilizó el programa Spartan Pro ´06 V102 a nivel de HF/6-31G y se comparó el confórmero más estable con la estructura obtenida por difracción de rayos X, siendo muy semejantes. A las cepas utilizadas en este trabajo, se les determinó la producción de la enzima β-lactamasa, a través, de la prueba de cefinace. Siguiendo los lineamientos de la CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) se desarrollaron las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana tanto en microplacas como en agar, usando como antibiótico de referencia a la ampicilina dentro del intervalo de concentración de 0,5-256 µg/mL, se determinó que la concentración mínima inhibitoria (CMI) fué de 4µg/mL para las bacterias E.coli ATCC 35198 y E.coli 25922, y de 32µg/mL para la bacteria K. pneumoniae 700603, lo que corroboró que efectivamente ambas cepas de E.coli son sensibles a la ampicilina y la cepa de K. pneumoniae es resistente. En el estudio de sinergismo se utilizó de referencia la combinación de cefotaxima/ácido clavulánico y ceftazidima/ácido clavulánico (30/10µg); observándose que K. pneumoniae (productora de β-lactamasa) se sensibilizó con esta combinación. Bajo las condicione descritas anteriormente se evaluaron los cuatro compuestos N-aril-espiro-βlactámicos sintetizados, obteniéndose que ninguno de ellos mostró actividad ni como inhibidores de las PBP´s (actividad antibiótica), ni como inhibidores de las β-lactamasas.

ABSTARCT: From the coming of penicillin, and its primary biological target; the penicillin binding protein (PBP´s) anchored in the cellular membrane bacterial and ordered of the final step of the biosynthesis of the cellular wall, It determine the way of action of these drugs. Nevertheless the indiscriminate use of such β-lactams antibiotics as penicillins and cephalosporines has been in the increase of the number of resistant bacterial strains to the present quimioterapeutic by the production of β-lactamases. Like a strategy to this mechanism of resistance of the bacteria, to new molecules with activity on PBP´s and/or β-lactamases have been developed. A proposal in this work is the synthesis of N-aryl-β-lactams, for which the reaction of Staudinguer was used, and consists of a cycle reaction addition [2+2] between a ketene and imine. The synthesis of four N-aryl-β-lactams sustituited (3a-3d) was taken by the addition of the ketene (2-Cloroetenone) generated in situ, to the corresponding ones isomaleimides to -78ºC and under nitrogen atmosphere, with greater yields of 60% after its purification. All the compounds obtained in the synthesis of these N-aryl-β-lactams were characterized by Infrared Spectroscopy (IR), Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of proton and carbon thirteen (RMN 1 H and 13C), as well as, Mass Spectrometry (GC-MS). Additionally the structure of these compounds was corroborated by mean of a study of x-rays diffraction of N- aril-β-lactam 3c, being observed an adjustment almost coplanar between the β-lactam ring and the aromatic ring of -51.8°. For the optimization of the geometry of the compound 3c Spartan Pro ´06 V102 program at level of HF/6- 31G was used and the most stable conformer with the structure obtained by x-rays diffraction was compared, being very similar. To the strains used in this work, the production of the β-lactamase enzyme was determined by the cefinace test. Following the standards of the CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) the tests of antimicrobial susceptibility in microplates were developed as much as in agar, using as antibiotic of reference to the ampicilline within the concentration interval from 0,5 to 256 µg/mL, determined that the minimal inhibitory concentration (MIC) was of 4µg/mL for the bacteria E.coli ATCC 35198 and E.coli ATCC 25922, and of 32µg/mL for the bacterium K. pneumoniae ATCC 700603, which corroborated that indeed both strains of E.coli are sensible to the ampicilline and the strain of K. pneumoniae is resistant. In the sinergism study the reference combinations used cefotaxime /acid clavulanic and ceftazidime/acid clavulanic (30/10µg); being observed that K. pneumoniae (producing of β-lactamase) it was sensitized with this combination. Under that conditions previously described were evaluated the four compound N-aryl-β-lactamics synthesized, obtaining that no of them showed activity neither as inhibitors of the PBP´s (antibiotic activity), nor as inhibitors of β-lactamases.