Formación in vitro de tejido testicular mediante ingeniería de tejidos, en un modelo de conejo

Abstract

ABSTRACT: The purpose of this work was to create in vitro functional testicular tissue by means of tissue engineering techniques, that could in the long term, become a new alternative in the treatment of patients with absence of testicles or with infertility problems. We used Leydig and Sertoli culture cells from young New Zeland rabbit testis. The purity of the Leydig cells was measured with anti3bHSD and antivimentin antibodies; 99% of these cells were positive to both antibodies. The same cells were antitransferrin and antia inhibin negative. On the other hand, the presence of Sertoli cells was confirmed by the presence of ainhibin at 1015%. A similar percent of the population was positive to transferrin, although 90% of these cells were GATA6 positives and Müllerian inhibitor substance (MIS) and IL2 receptor (IL2R) negatives. 3[ 4,5Dimetiltiazol2il] 2,5diphenylbromure tetrazollium (MTT) assays at day 45 in the monolayer cultures (without polymer), showed that cells in coculture proliferated more than individual cultures (p<0.005). Testosterone levels of the conditioned medium were higher in cocultured than in Leydig cells alone. 3D cultures were obtained by seeding Leydig and Sertoli cells into three different scaffolds, resulting from the combination of three different synthetic polymers: polyglycolic acid/polypirrol (PGA/PPy), polyglycolic acid/polylacticacidcoglycolic (PGA/PLGA) and polyglycolic acid/polylacticacidcoglycolic/ polypirrol (PGA/PLGA/PPy). MTT assays demonstrated that testicular cells seeded in all three scaffolds proliferated for more than 80 days. Other experiments showed that addition of hGC (4Ul) lead testosteroneproduction at concentrations between 0.97 and 11.40 ng/mL, which were detected on the conditioned medium of the 3D cultures by ELISA assay. Finally, structural analysis by electronic microscopy showed that while the scaffold hydrolyzed slowly, it was replaced by testicular cells and extracellular matrix; so that, we obtained a neotissue of about 12 mm thickness. On the basis of the results, the conclusion of this work is that through the application of tissue engineering techniques, it is possible to create a neotissue in vitro from a coculture of Leydig and Sertoli cells seeded into a biodegradable and synthetic biopolymer such as PGA/PPy that could synthesize and liberate testosterone in a long term.

RESUMEN: El objetivo de este trabajo fue obtener un tejido testicular funcional in vitro, mediante la ingeniería de tejidos, como una nueva alternativa en el tratamiento de pacientes con ausencia testicular. Se utilizaron células de Leydig y de Sertoli provenientes de testículos de conejos Nueva Zelanda púberes. La pureza de las células de Leydig se determinó mediante anticuerpos anti3bdeshidrogenasa (3bHSD) y antivimentina, el 99% de estas células fueron positivas, pero con antiinhibina a y antitransferrina resultaron negativas. Por otro lado, las células de Sertoli fueron identificadas por la presencia de la proteína inhibina a en un 1015%. Otro 1015% fueron positivas a la proteína transferrina, aunque el 90% son positivas a GATA6, negativas a la proteína inhibidora Mülleriana (MIS) y al receptor de la interleucina2 (IL2R). Mediante el método colorimétrico del 3[4,5Dimetiltiazol2il] 2,5—difenilbromuro de tetrazolio (MTT) se demostró en los cultivos en monocapa (sin polímeros) y a un plazo de 45 días, que las células en cocultivo proliferan más que si se cultivan por separado, con diferencias significativas (p<0.005). Los niveles de testosterona detectados resultaron ser ligeramente más elevados en los cocultivos que en los cultivos de las células de Leydig. Los cultivos en 3D se obtuvieron cultivando a las células de Leydig y de Sertoli en tres templetes resultantes de la combinación de tres polímeros sintéticos: ácido poliglicólico/polipirrol (PGA/PPy), ácido poliglicólico/ácido polilácticocoglicolico (PGA/PLGA), y ácido poliglicólico/ácido polilácticocoglicólico/polipirrol (PGA/PLGA/PPy). Se demostró que las células testiculares proliferan en todos los templetes por más de 80 días. Al adicionar la hormona gonatropina coriónica (hGC) (4UI), se indujo la producción de testosterona en concentraciones de entre 0.97 y 11.40 ng/mL, (detectados en los sobrenadantes mediante ensayos de ELISA). Finalmente, el análisis estructural por microscopía electrónica de barrido mostró que mientras los templetes se hidrolizaban poco a poco, éstos se sustituían por las células testiculares y por matriz extracelular; de esta manera, se obtuvo un neotejido de 12mm de grosor. En base a los resultados mencionados, se concluye que al aplicar técnicas de ingeniería de tejidos es posible formar un neotejido in vitro a partir de un cocultivo de células de Leydig y Sertoli en biopolímeros combinados con PGA/PPy, y que es funcional, ya que es capaz de sintetizar y liberar testosterona a largo plazo.