Análisis fenotípico y genotípico de genes inducibles que confieren resistencia MLSb en cepas de estafilococos coagulasa negativa

Abstract

ABSTRACT: The coagulase negative staphylococci (CNS) are part of the normal microbiota in the human skin and mucosal surfaces, but have frequently been isolated from clinical and potential infectious agents and their increased incidence is widely recognized. This is due in part to the ability of resistance to macrolides, lincosamides and streptogramins type B (MLSB) antibiotics, that are frequently used in the treatment. In CNS, the MLSB resistance can be of the inducible (iMLSB) or constitutive (cMLSB) types, and is determined by genes refered as erythromycin ribosome methylation (erm): erm(A), erm(B) and erm(C). Those genes carry out a postranscripcional methylation in the 50S subunit of the mRNA, causing a decrease in the binding of antibiotics to their targets sites in the ribosomes. The aim of this study was to perform molecular analysis of the erm genes that are present in strains of Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus haemolyticus that were isolated in the General Hospital of Acapulco, to determine the inducible resistance to clindamycin. From November 2000 to September 2004 our group performed a collection of 141 isolates of ECN from the Hospital General de Acapulco, Mexico. Of the 141 isolates, 5 resulted in a phenotype iMLSB, three corresponded to S. epidermidis and two to S. haemolyticus and were considered as indicative of the presence of the genes erm(A), erm(B) and erm(C). We did a PCR directed to genes erm(A), erm(B) and erm(C) and their respective regulatory regions. The erm(A) gene was isolated only from S. haemolyticus, the gene erm(B) could not be found, while the gene erm(C) was found in the three S. epidermidis isolates. The sequencing analysis of regulatory regions for genes erm(A) and erm(C) showed a model of attenuation of translation. The regulatory region of the gene erm(A) consisted of two control peptides from 15 and 19 aminoacids, and the structural gene erm(A) coding for 243 amino acids. Not found any mutation in the gene sequences analyzed erm(A) or in its regulatory region. While the nucleotide sequence of the regulatory region of erm(C) showed that consisted of a control peptide of 19 amino acids and the structural gene erm(C) coding for 243 amino acids. A type of silent point mutation was found in an isolate of S. epidermidis in the gene erm(C) identified in the position G2613C coding for glycine. In conclusion this study showed a significant correlation at the phenotypic and genotypic resistance analysis iMLSB, demonstrating that it can be a useful tool for characterization of strains CNS, and also that iMLSB resistance is caused by a mechanism of attenuation of translation.

RESUMEN: Los Estafilococos Coagulasa Negativa (ECN) forman parte normal de la microbiota en la piel humana y de las mucosas, sin embargo frecuentemente se han aislado de cuadros clínicos como potenciales agentes infecciosos y su incremento de incidencia está ampliamente reconocido. Esto se debe en parte, a la capacidad de resistencia a los macrólidos, lincosamidas y las estreptograminas tipo B (MLSB), que son los antibióticos de uso más frecuente en las infecciones causadas por los ECN. En los ECN la resistencia MLSB puede ser de tipo inducible (i MLSB) o constitutiva (c MLSB) y está determinada por los genes erythromycin ribosome methylation (erm): erm(A), erm(B) y erm(C) que realizan la metilación postranscripcional en el mRNA de la subunidad 50S, causando una disminución en la unión de los antibióticos a sus sitios blancos en el ribosoma. El objetivo de este trabajo fue realizar el análisis molecular de los genes erm que están presentes en cepas de Staphylococcus epidermidis y de Staphylococcus haemolyticus que presentan el fenotipo de resistencia inducible a la clindamicina y que fueron aisladas en el Hospital General de Acapulco. De Noviembre del 2000 a Septiembre del 2004 nuestro grupo realizó una colecta de 141 aislados de ECN provenientes del Hospital General de Acapulco, México. De los 141 aislados, 5 resultaron con un fenotipo iMLSB, 3 de S. epidermidis y 2 de S. haemolyticus y fueron consideradas como indicativas de la presencia de los genes erm(A), erm(B) y erm(C). Se realizó una PCR dirigida a los genes erm(A), erm(B) y erm(C) y sus respectivas regiones reguladoras. La localización por PCR del gen erm(A) fue en 2 aislados de S. haemolyticus, el gen erm(B) no se encontró, mientras que el gen erm(C) se localizó en 3 aislados de S. epidermidis. El análisis de secuenciación de las regiones reguladoras correspondientes a los genes erm(A) y erm(C) mostraron un modelo de “atenuación de la traducción”. La región reguladora del gen erm(A) está formada por dos péptidos control uno de 15 y otro de 19 aminoácidos y el gen estructural erm(A) que codifica para 243 aminoácidos. No se encontró ningún tipo de mutación en las secuencias analizadas del gen erm(A) ni en su región reguladora. Mientras que la secuenciación nucleotídica de la región reguladora de erm(C) demostró que está formada por un péptido control de 19 aminoácidos y el gen estructural erm(C) que codifica para 243 aminoácidos. Un tipo de mutación puntual se localizó en un aislado de S. epidermidis en el gen erm(C) identificada en la posición G2613C que codifica para glicina. En conclusión este estudio demostró una importante correlación fenotípica y genotípica en el análisis de resistencia iMLSB, demostrando que puede ser una útil herramienta para la caracterización de cepas ECN, además de que la resistencia iMLSB es producida por un mecanismo de atenuación de la traducción.