Expresión de las proteínas de estrés de la soya (Glycine max) durante la germinación a diferentes valores de Ph y concentración salina

Abstract

ABSTRACT: This is a proteomic study of soybean Huasteca 100 (Glycine max, L., Merril), subjected to diverse stressing conditions. Soybean Huasteca-100 was selected from within four soybean varieties (Crystalline, Huasteca 100, UFV-01 and FTV-0191) on the basis of its general quality characteristics, including grain integrity, germination index, and lipid and protein contents. The study was carried out under the hypothesis that stressing conditions other than heat, such as abnormal salinity, acidity or alkalinity, could similarly affect the growing of the plants and simultaneously induce a stress response aiming to resist or recover from the negative effects of the stressing conditions. To test this hypothesis, the effect of diverse culture conditions (pH 5.5, 7.0 and 8.0; NaCl 50, 100 and 200 mM, and heat at 40oC, 42oC and 45oC) on the germination ability of soybean and on the stress response of this crop was investigated. The analysis of proteins in the embryonic axes of soybean seeds subjected to the several stress stimuli, involved protein quantification by a micro-Lowry technique, protein fractionation by PAGE-SDS-ME, immunodetection by Western blot, two-dimension gel electrophoresis (2D DIGE), mass spectrometry by MALDI-TOF MS and TOF/TOF tandem MS/MS, and utilization of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) data bases. It was found that the stressing factors HS(40oC/2h), pH 5.0, pH 8.0 and NaCl 200 mM, all induced the expression of several stress proteins (HSP-102, HSP-100, HSP-54, HSP-47, HSP- 29, HSP-28, HSP 25.6, and HSP-9) that were common for all stressing conditions. Particular HSPs appeared under the effect of HS(40oC/2h) (36.8 kDa), and 200 mM NaCl (22 kDa). The Wester-blot analysis with a rabbit antiserum to HS(40oC/2h)-induced HSPs revealed results similar to the ones observed by PAGE-SDS-ME. Proteomic analysis of the proteins extracted from the embryonic axes of soybean subjected to the above mentioned stressing conditions by 2D DIGE-CyDye Fluor, revealed over 2000 protein spots for each stressing condition, among which 35 were identified as HSPs. All of the 35 HSPs detected under one stressing condition were the same found under the other stressing factors. Five of the protein dots that showed the highest expression indexes and were commonly induced under the several stressing conditions tested were analyzed by mass spectroscopy by MALDI-TOF MS y TOF/TOF tandem MS/MS. The resulting spectra were algorithm (MASCOT) processed and identified in the NSBI data bases for soybean. This methodology allowed us to identify the following HSPs: (1) Chain C of proglycinin A1ab1b in spots ID 22 and ID 24; (2) Subunit G1 of glycinin in spot ID 16; (3) Chain C of beta-conglycinin in spot 8, and (4) Cytosolic Glutamin synthetase in spot 32. From the proteins identified in the present study, it is known that proglycinin A1ab1b is a chaperonin but its role has not been related to the abiotic stress response. Beta-conglycinin has been identified as a store protein but, again, its role as a stress protein has not been reported. Finally, identification of Cytosolic glutamil synthetase alpha as a stress protein is an important finding as this enzyme is a key participant in the capture and metabolism of inorganic nitrogen in plants.

RESUMEN: Este es un estudio proteómico de la soya (Glycine max, L., Merril), variedad Huasteca 100, sujeta a diversas condiciones de estrés. La soya Huasteca 100 se seleccionó a partir de cuatro variedades (Cristalina, Huasteca-100, UFV-01 y FTV-0191), en función de sus características generales de calidad: integridad, germinación y contenido en lípidos y proteínas. El estudio se realizó sobre la hipótesis de que condiciones estresantes diferentes al calor (salinidad, acidez y alcalinidad excesivas) podrían afectar el crecimiento de las plantas, y que las plantas para resistir las condiciones estresantes, o para recuperarse de sus efectos, deberían mostrar una respuesta de estrés. Para probar la hipótesis se analizó el efecto del pH (5.5, 7.0 y 8.0), de la salinidad (NaCl 50, 100 y 200 mM) y del calor (40oC, 42oC y 45oC) sobre la germinación de la soya y sobre su respuesta al estrés. La metodología para el análisis de proteínas en los extractos de los ejes embrionarios de la soya control y sometida al estrés, incluyó la cuantificación de proteínas por el método de Lowry (microensayo), el fraccionamiento de proteínas mediante PAGE-SDS-ME, el análisis de proteínas por Western blot, y la identificación de 5 proteínas HSP utilizando técnicas proteómicas (2D DIGE y MALDI-TOF MS y TOF/TOF tandem MS/MS), así como la consulta de la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Se encontró que los factores de estrés HS(40oC/2h), pH 5.5 y 8.0, y NaCl 200 mM, indujeron incremento en varias proteínas, incremento que fue detectado en los geles PAGE-SDS-ME. Se observó que 8 de estas bandas de proteína (HSP-102, HSP-100, HSP-54, HSP-47, HSP-29, HSP-28, HSP-25.6, y HSP-9) fueron comunes para todos los factores estresantes, mientras que una banda (36.8 kDa) fue particular para el factor HS(40oC/2h) y otra (22 kDa) para el factor NaCl 200 mM. La inmuno-detección por Wester blot utilizando un antisuero de conejo dirigido contra las proteínas de estrés inducidas por HS(40oC/2h) dio resultados similares a los observados por PAGE-SDS-ME. Cinco de las manchas de proteína que mostraron los mayores incrementos y que fueron comunes para todas las condiciones de estrés fueron analizadas por espectrometría de masas MALDI-TOF MS y TOF/TOF tandem MS/MS. Los espectros de masas generados fueron interpretados mediante algoritmos (MASCOT) e identificados en referencia a la información sobre el proteoma de la soya contenida en la base de datos NCBI. Esta metodología permitió identificar las siguientes proteínas que se comportaron como proteínas de estrés o HSPs: (1) Dos isómeros de la cadena C de la proglicinina, homotrimero A1ab1b en las manchas ID 22 e ID 24; (2) Subunidad G1 de la glicinina en la mancha ID 16, (3) Cadena C de la beta-conglicinina en la mancha ID 8 y (4) Glutamina sintetasa citosolica alfa en la mancha 32. De las proteínas identificadas en este estudio, se sabe que la proglicinina A1ab1b funciona como chaperona pero no se ha relacionado con la respuesta al estrés abiótico. La beta conglicinina se ha descrito como una proteína de reserva pero tampoco no se ha reportado su papel como proteína de estrés. Finalmente, la identificación de la Glutamil sintetasa alfa citosólica como proteína de estrés en este estudio es un hallazgo importante porque esta es una enzima clave en el almacenamiento y metabolismo del nitrógeno inorgánico en plantas.