Estudios de fármacos que aumentan la transfección genética mediada por lipofección

Abstract

ABSTRACT: Gene therapy is a strategy for the transference of genes into specific cells from animals or humans, in order to correct genetic alterations that cause diseases. Currently, gene therapy is in experimental phase, and one of its main challenges is the finding of optimal conditions for gene transfer. In lipoplexes-mediated transfection (lipotransfection), DNA interacts with liposomes, which penetrate into cells by direct fusion with cell membranes or through endocytosis. The lipotransfection mediated by lipofectamine-DNA lipoplexes is generally low (25%), which is a limitation for the use of lipofectamine in protocols for human gene therapy. Therefore, in this work we determined if the lysosomotropic chloroquine, the polyamine spermidine and the inducers of membrane fusion chlorpromazine and procainamide, could improve the reproducibility and efficiency of lipotransfection with lipofectamine. Chloroquine, chlorpromazine, procainamide, spermidine and their mixtures had the same cytotoxicity on C-33 A and HEK 293 cells, as determined by trypan blue stain and Alamar blue techniques. This similar cytotoxicity of the drugs allowed their use in this study, because the differences found in gene transfection could be attributed to the physiological effect of the drugs and not to their cytotoxicity. For gene transfection experiments, we used drug concentrations in which cell viability was higher than 80%. Gene transfection with lipofectamine-pRSVβgal lipoplexes was 100% higher in HEK 293 transformed cell than in C-33 A carcinoma cell line. In addition, the increase in gene transfection of 175% in HEK 293 and 150% in C-33 A cells in the presence of the lysosomotropic chloroquine suggests that the lipoplexes penetrated into both cell lines through endocytosis. The decreases of gene transfection to 90% in the presence of the drugs that induce membrane fusion confirms that the penetration of lipoplexes occurred by endocytosis. The highest gene transfection, 175% in C-33 A and 250% in HEK 293 cells, was attained when the lysosomotropic agent and the inducers of membrane fusion were used in combination. This increased transfection can be attributed to the combined effect of both drugs. On one hand, chlorpromazine and procainamide induced the formation of lipidic particles, which increased the fusion of membranes and thus improved the penetration of lipoplexes into the cells by endocytosis. On the other hand, chloroquine caused an increase in the phagolysosomal pH that inhibits their enzymes, in addition chloroquine caused an alteration in the phagolysosomal membrane, which led to the lipoplexes release into the cytoplasm. The lipoplexes could then reach the nucleus and produce gene transfection. Spermidine, which increased gene expression and cell division, produced an increase in gene transfection in both cell lines. Furthermore, the mixture of spermidine and chloroquine produced an increase in transfection of 80% in C-33 A and 200% in HEK 293 cells. When mixtures of spermidine plus chlorpromazine or procainamide were used, the effect of the inducers of membrane fusion was dominant, but their effect was lightly impaired by the presence of spermidine, because the decrease in transfection was about 70%, compared with the 92% produced by chlorpromazine or procainamide in the absence of the polyamine. These findings demonstrate that an adequate mixture of compounds with desirable properties (inducers of membrane fusion, lysosomotropics and/or inducers of gene expression and cell division) can produce an important increase in the efficiency of gene transfection with lipofectamine-containing lipoplexes. This could lead to a future application in protocols of gene transfection in humans.

RESUMEN: La terapia génica es una estrategia para transferir genes al interior de células específicas de animales o del hombre para corregir enfermedades causadas por alteraciones genéticas. Actualmente se encuentra en fase experimental y uno de sus principales retos es encontrar las condiciones óptimas para la transferencia de genes. En la lipotransfección el DNA interacciona con liposomas que penetran a la célula por fusión directa con la membrana o por endocitosis. La lipotransfección con lipocomplejos de lipofectamina-DNA es en general baja (?25%), lo que representa una limitante para aplicar la lipofectamina en protocolos de terapia génica en humanos. Por lo que en este trabajo se determinó el efecto del lisosomotrópico cloroquina, la poliamina espermidina, los fármacos que promueven fusión membranal cloropromacina y procainamida, para tratar de mejorar la reproducibilidad y eficiencia de la lipotransfección mediada por lipofectamina. Los fármacos cloroquina, cloropromacina, procainamida, espermidina y sus mezclas tuvieron el mismo efecto citotóxico en los cultivos de células C-33 A y HEK 293, determinado por las técnicas del azul tripan y azul Alamar. La similitud en la citotoxicidad de los fármacos permite su aplicación en el presente estudio, porque las diferencias en la transfección se podrán atribuir al efecto fisiológico y no al citotóxico de los fármacos. Para la transfección genética se seleccionaron las concentraciones de fármacos que permitieran una viabilidad celular mayor al 80%. La transfección genética se llevó a cabo con los lipocomplejos de lipofectamina-pRSV?gal, y fue 100% mayor en la línea HEK 293 de células transformadas con respecto a la línea de células cancerosas C-33 A. La transfección en presencia del lisosomotrópico cloroquina aumentó a 175% en HEK 293 y 150% en C-33 A, lo que sugiere que los lipocomplejos penetraron en ambas líneas por endocitosis, esto fue confirmado porque con los fusionadores de membrana la transfección disminuyó hasta un 90% en ambas líneas. El mayor efecto en la transfección genética, 175% en células C-33 A y 250% en HEK 293, se obtuvo cuando los fármacos fusionadores de membrana se usaron junto con el lisosomotrópico. Este incremento se puede atribuir al efecto combinado de ambos fármacos: los fusionadores inducen la formación de partículas lipídicas y estos arreglos lipídicos intervienen en la fusión de membranas lo que promueve la internalización de los lipocomplejos vía endocitosis, adicionalmente la cloroquina interfiere con la endocitosis ya que al incrementar el pH del fagolisosoma inhibe sus enzimas, además lo desestabiliza lo que permite que se liberen los lipocomplejos al interior de la célula y puedan alcanzar el núcleo y llevar a cabo la transfección. La espermidina la cual aumenta la expresión genética y la división celular, produjo un aumento en la transfección en ambas líneas celulares y la mezcla de espermidina más cloroquina causó un aumento en la transfección de 80% en C-33 A y de 200% en HEK 293. Al usar mezclas de espermidina con cloropromacina o procainamida predominó el efecto de los fusionadores de membrana de favorecer la endocitosis de los lipocomplejos y su degradación lisosomal, este efecto fue ligeramente compensado por la espermidina porque la disminución en la transfección fue alrededor del 70%, comparada con el 92% producido por los fusionadores membranales en ausencia de la poliamina. Estos hallazgos han mostrado que la combinación adecuada de compuestos que tienen propiedades de favorecer la fusión membranal, de inhibir las enzimas hidrolíticas de los fagolisosomas y de desestabilizarlos, así como de aumentar la división celular y la expresión genética, aumentan de forma muy importante la eficiencia de la transfección genética con lipocomplejos de lipofectamina, lo que permitirá su aplicación en protocolos de terapia génica en humanos.