Las balsas lipídicas (Lipid Rafts) modulan el proceso de comunicación macrófago-micobacteria

Abstract

ABSTRACT: Cell membrane cholesterol is required for viability and cell proliferation. More than 90% of cellular cholesterol is located at the plasma membrane. Several microorganisms and bacterial products target membrane rafts, which are membrane microdomains of eukaryotic cells, enriched in cholesterol, sphingolipids, and certain proteins. Cholesterol confined in membrane rafts is a crucial component required by microorganism, to directly enter or exit the intracellular compartments. The mycobacterial cell wall is rich in glycolipids containing putative high-affinity cholesterol-binding sites and thus it has been postulated that cholesterol may function as a direct “docking site” for mycobacteria. Depletion of plasma membrane cholesterol by filipin, nystatin or methyl- .cyclodextrin treatment, significantly reduces phagocytosis of mycobacteria. The cross-linking of receptors embedded in small raft domains results in the coalescence of rafts into large assemblies that bring receptors into proximity with high concentrations of second-messenger molecules, thus initiating signaling cascades. GPI-anchored proteins, cholesterol, and so far unidentified components of membrane rafts may be utilized by several microorganisms as their cellular receptors. Mycobacteria, bind to a variety of cells surface receptors on macrophages, including complement-, mannose- , Fc-, or scavenger- receptors. This work analyzes the cell membrane compartmentalization of several well known receptors for mycobacterial ligands, upon stimulation of murine macrophages with M. tuberculosis-secreted molecules. It is shown that M. tuberculosis secreted molecules induce the rapid mobilization of rafts, as assessed by real time confocal microscopy, as well as a differential segregation of CD14, CD35, CD206, and TLR-2. Moreover, stimulation of murine macrophages with M. tuberculosis-secreted molecules, followed by membrane rafts isolation and SDS-PAGE showed a differential expression of several proteins that were identified, following protein sequencing, as heat shock 70 kDa proteins, moesin (Membrane-organizing extension spike protein), protein disulfide-isomerase, glycine-tRNA ligase, precursor, nexin 2 variant and phosphoglycerate kinase 1 (Primer recognition protein 2) (PRP 2). Taken together our results indicate a rapid change in membrane rafts composition as a result of macrophage stimulation with M. tuberculosis-secreted molecules and which may prepare the host cell, at the level of membrane rafts, for infection, a process we refer to as “membrane rafts maturation”.

RESUMEN: El colesterol de la membrana celular es requerida para la viabilidad y proliferación celular. Más del 90% del colesterol celular esta localizado en la membrana plasmática. Varios microoganismos y productos bacterianos se unen a los rafts, los cuales son microdominios de membrana, enriquecidos en colesterol y esfingolípidos y algunas proteínas. El colesterol confinado a los rafts es un componente crucial que es requerido por los micoorganismos, para entrar y salir de los compartimentos intracelulares. La pared de la micobacteria esta enriquecida en glicoplípidos que contienen sitios de unión al colesterol y se ha postulado que el colesterol puede actuar como “puerta de entrada” para la micobacteria. La depleción de colesterol de la membrana plasmática por el tratamiento con filipina, nistatina o metil ? ciclodextrina reduce significativamente la fagocitosis de la micobacteria. La unión de los ligandos a sus receptores induce su translocación hacia los lipid rafts, los cuales llegan a formar estructuras alargadas, estables y que presentan altas concentraciones de segundos mensajeros, tal como las proteínas de aclaje a GPI, entre otros, activandose asi las vías de señalización. La micobacteria se une a una gran variedad de receptores que se encuentran sobre la superficie del macrófago, incluyendo a receptores de manosa, complemento, Fc o scavenger. En este trabajo analizamos la compartamentalización en la membrana celular de varios receptores para ligandos micobacterianos, demostrando que la estimulación de los macrófagos murinos con moléculas de secreción de M. Tuberculosis induce a una rápida movilización de los lipid rafts, como se evaluó en microscopia confocal a tiempo real, asi como también la segregación diferencial de CD14, CD35, CD206 y TLR2. Sin embargo, la estimulación de macrófagos murinos con extractos solubles de M. tuberculosis, seguido por el aislamiento de los lipid rafts y su corrimiento en SDSPAGE mostró una expresión diferencial de varias proteínas que fueron identificadas por micro-secuenciación, entre las que se encontratron la proteína de choque térmico de 70 KDa, moesina, isomerasa disulfido, precursor de la ligasa de glicinatRNA, nexina 2 y fosfogliceratocinasa 1. Nuestros resultados sugieren que existen cambios dinámicos en la composición de los rafts de la membrana como resultado de la estimulación de los macrófagos con productos de secreción de M. tuberculosis; estos cambios pudieran estar preparando a la célula para la infección, un proceso que nosostros hemos denominado “maduración de lipid rafts”.