El papel central de Burkholderia sp. en la degradación del herbicida 2,4-d, por un cultivo mixto inmovilizado en un reactor de lecho fijo

Abstract

ABSTRACT: Soil samples collected from the central region of Veracruz, Mexico were used as a source of microorganisms able to degrade the herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), and two of its biodegradation byproducts, 4-chlorophenol (4-CP) and 2,4- chlorophenol (2,4-CP. These microorganisms were enriched by successive transfer of microbial cells batch cultivated in basal medium to which the above mentioned compounds were added as carbon and energy sources. The microbial community immobilized in a packed bed column reactor (PBCR) was used to evaluate the biodegradation kinetics of several proportions of the mixed chloroaromatic compounds (4-CP, 2,4-CP and 2,4-D). The packed bed column was aerobically operated at low dilution rate (D = 0.005 h-1), sampling the liquid and fragments of porous support containing attached biomass at six different levels. To evaluate the axial change in composition along the PBCR, liquid samples were analyzed by HPLC and COD. It was observed that the increase of 4-CP and 2,4-DCP in the mixture of chloroaromatics reduced the overall and individual removal-efficiency of the aromatic compounds. In particular, byproducts accumulation in PCBR was notable when 2,4-DCP proportion was increased in the medium fed to the PCBR. As the liquid stream fed to the packed bed column flows upwards, concurrently with the injected air, an axial gradient in biomass concentration attached to the porous support was also observed. Attached biomass was quantified by nitrogen content and viable cell count determinations in the porous support. Biofilm growth was confirmed also by microscopic observation of stone samples obtained at each one of the different packed bed strata. Micrographs obtained showed coccoid and rod-shaped bacteria. Species richness (the number of species present in a sample) was determined in the packed bed column by PCR-TGGE. Five different species prevailed in the biofilm reactor. From the microbial biofilm selected, bacterial strains were isolated and identified by sequencing fragments of their bacterial 16S rDNA. Their bacterial genera were: Achromobacter, Burkholderia, Leifstonia, Klebsiella and Stenotrophomonas. Bacterial strains were studied, searching for catabolic plasmids containing the tfd A gene that encodes the enzyme 2,4- dichlorophenoxyacetic acid:alpha-ketoglutaric acid dioxygenase (TfdA). With the exception of Klebsiella sp., the remaining strains possessed one or more plasmids. The isolated Burkholderia sp. strain contains two plasmids; one of about 9.5 Kbp and another of about 23 Kbp, which resulted positive for the tfdA gene. The presence of specific genes for Burkholderia sp., together with the tfdA gene were monitored in the DNA extracted from different packed bed strata. It was observed that both genes were present mainly in the lower and central part of the column bioreactor. The five bacterial strains were separately evaluated in batch culture for their biodegradation rates and removal efficiencies of each one of the chloroaromatics used. All strains were able to degrade 2,4-D, 2,4-DCP and 4-CP; however, noteworthy differences were observed in their corresponding biodegradation rates. From the five strains tested individually, Burkholderia sp. showed the best kinetic behavior. Using Burkholderia sp. as bacterial strain pivot, binary cultures were arranged and tested for their ability to degrade 2,4-D. In no case the kinetic results surpassed those obtained with Burkholderia sp. alone. When this strain was immobilized in a PCBR, continuously operated as axenic culture, in spite that the herbicide loading rate was greatly increased, it was not reached the maximum loading rate (BV,24D-limit) supported by the biofilm bioreactor.

RESUMEN: Muestras de suelo colectadas de la región central de Veracruz, México., se usaron como fuente aislamiento de microorganismos capaces de degradar el herbicida ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D) y dos productos de la biodegradación de éste, 4-clorofenol (4- CF) y 2,4-diclorofenol (2,4-DCF). La comunidad microbiana aislada fue enriquecida por transferencias sucesivas en cultivo por lote de células crecidas en medio basal con fuentes de carbono y energía. La comunidad microbiana fue inmovilizada un reactor lecho empacado (PBCR) que fue usado para evaluar cinéticamente la biodegradación en varias proporciones de mezclas de los compuestos cloroaromáticos (4-CF, 2,4-DCF y 2,4-D). La columna de lecho empacado fue aeróbicamente operada a baja velocidad de dilución (D=0.005 h-1), se tomaron a seis diferentes niveles muestras del líquido y fragmentos del soporte poroso conteniendo biomasa adherida. Para evaluar el cambio axial en la composición a lo largo del PCBR, se tomaron muestras líquidas y fueron analizadas por HPLC y DQO. Se observó que el incremento de 4-CF y 2,4-DCF en la mezcla, reduce las eficiencias de remoción globales e individuales de los compuestos cloroaromáticos. En particular la acumulación de subproductos en el PCRB fue notable cuando la proporción de 2,4-DCF se incrementó. La corriente de alimentación liquida de la columna de lecho empacado tenía un flujo ascendente, al mismo tiempo se inyectó aire, observándose un gradiente axial en la concentración de biomasa adherida al soporte poroso. La biomasa adherida al soporte poroso fue cuantificada por contenido de nitrógeno y por células viables. El crecimiento de la biopelícula fue además confirmando por la observación microscópica de muestras de piedra obtenidas en cada uno de los diferentes niveles de lecho empacado. Las micrografías obtenidas por observación microscópica mostraron bacterias en forma de cocos y bacilos. La riqueza de especies (número de especies presente en una muestra) fue determinada en la columna de lecho empacado por PCR-TGGE. De la biopelícula microbiana, fueron aisladas cepas bacterianas y se identificaron por la secuenciación de fragmentos del 16S rDNA. Los géneros encontrados fueron: Achromobacter, Burkholderia, Leifsonia, Klebsiella y Stenotrophomonas. Las cepas bacterianas que fueron estudiadas y se buscó el gen tfd A que codifica para la enzima acido 2,4-diclorofenoxiacético: alfa-cetoglutarico dioxigenasa (tfd A). Con excepción de Klebsiella sp., las demás poseían uno o más plásmidos. La cepa de Burkholderia sp. contenía dos plásmidos; uno de aproximadamente 9.5 Kpb y otro de aproximadamente 23 Kpb, en éste último se encontró el gen tfd A. La presencia de los genes específicos para Burkholderia sp., junto con el gen tfdA fueron monitoreados en el DNA extraído de diferentes estratos de lecho empacado. Se observó que ambos genes se localizan principalmente en la parte más baja y central de la columna del bioreactor. Las cinco cepas bacterianas fueron evaluadas separadamente en cultivos por lote, teniendo diferentes velocidades de biodegradación y eficiencias de remoción cada una en cada uno de los cloroaromátios usados. Todas las cepas pudieron degradar 2,4-D, 2,4- DCF y 4-CF; sin embargo, se observaron diferencias en sus correspondientes velocidades de degradación. De las cinco cepas evaluadas individualmente, Burkholderia sp. mostró el mejor comportamiento cinético. Usando Burkholderia sp. como cepa central, se usaron cultivos binarios y se evaluó la capacidad de éstos cultivos para degradar 2,4-D. En ningún caso los resultados de la cinéticos sobrepasaron a los obtenidos con el cultivo que contenía únicamente a Burkholderia sp. Cuando esta cepa fue inmovilizada en el reactor continuo de lecho empacado (PCBR), mismo que se operó como un cultivo axénico, a pesar de que la carga volumétrica del herbicida se aumentó, no se alcanzó la velocidad de carga máxima (Bv 2,4D) soportado por la biopelícula del reactor.