Efecto de la oxidación por radicales libres, sobre la estructura y función de la insulina

Abstract

RESUMEN: El estrés oxidativo ocurre cuando la producción de Especies Reactivas de oxígeno (ERO) sobrepasa las defensa antioxidante endógena. La peroxidación inducida por las ERO son la clave de las modificaciones químicas y estructurales de las biomoléculas, incluyendo a las proteínas circulantes. Para elucidar el efecto de las ERO sobre las proteínas circulantes y considerando la presencia de estrés oxidativo en Diabetes Mellitus, los efectos de las ERO, in vitro, sobre la insulina fueron estudiados. Nosotros utilizamos la reacción de Fenton para generar los radicales libres Hidroxilo (HO● ) en presencia de insulina humana recombinante, midiendo los cambios químicos de su estructura molecular. Los cambios inducidos en la insulina fueron: a) un incremento significativo sobre la absorbancia (280 nm) debido a la hidroxilación de las fenilalaninas (0.023 ± 0.007 to 0.13 ± 0.07), b) sobre las cadenas laterales de los aminoácidos se formaron productos de peroxidación, medidos como la capacidad de reducir al nitroazul de tetrazolio (NBT) a formazan (0.007 ± 0.007 to 0.06 ± 0.02), c) incrementada concentración de grupos carbonilos libres (8.8 ± 8.7 to 45.6 ± 20.2 pmoles dinitrophenylhidrazones/nmol insulin), d) formación de ditirosinas evidenciada desde los dos primeros minutos (de 32079 a 43145 unidades arbitrarias de fluorescencia) con la pérdida de la estructura secundaria y c) modificación de los epítopos de la insulina, decrementando la reactividad antigeno-anticuerpo medida como decremento en la concentración de insulina por Radioinmunoanálisis (RIA). Los cambios estructurales y químicos en la molécula de insulina son relacionados con la pérdida de la actividad biológica, evaluada midiendo el incremento en la utilización de U-14Cglucosa por el tejido adiposo humano en un sistema de radiorespirometría. La oxidación de la glucosa (14CO2) por las células adiposas fue incrementada en un 35 % ( 301 ± 119 to 407 ± 182 cpm/mg peso seco p < 0.05) en presencia de 0.1 UI y 69 % (301 ± 119 to 510 ± 266 cpm/mg peso seco p < 0.05) para 1.0 IU de insulina. La insulina recombinante humana oxidada por 5 minutos solo incremento la oxidación de la glucosa en un 25 %. En conclusion, estas observaciones demostraron que los cambios químicos en la insulina debido a su oxidación in vitro disminuye y puede abolir su actividad biológica. Nuestras condiciones experimentales representan el estrés oxidativo presentes en el plasma de pacientes con Diabetes mellitus y muestra que la insulina puede ser dañada de esta manera in vivo.

ABSTRACT: Oxidative stress occurs when the production of reactive oxygen species (ROS) exceeds the endogenous antioxidant defense. Peroxidations induced by ROS are the key of chemical and structural modifications of biomolecules including circulating proteins. To elucidate the effect of ROS on circulating proteins and considering the presence of oxidative stress in Diabetes Mellitus, the effects of ROS, in vitro, on human insulin were studied. We utilized the Fenton reaction for free hydroxyl radical (HO● ) generation in presence of human recombinant insulin measuring chemical changes on its molecular structure. The induced changes in insulin were: a) significant increase on absorbance (280 nm) due to phenylalanine hydroxylation (0.023 ± 0.007 to 0.13 ± 0.07). b) On amino acids side branches peroxidation products (peroxyl and alcohoxyl group); measured as increased capacity of reduce nitroblue of tetrazolium (NBT) to formazan (0.007 ± 0.007 to 0.06 ± 0.02). c) Increased concentration of free carbonyl groups (8.8 ± 8.7 to 45.6 ± 20.2 pmoles dinitrophenylhidrazones/nmol insulin). d) Dityrosine formation was evident since 2 minutes (of 32079 a 43145 fluorescence arbitrary units) with lost of secondary structure and e) Modification of epithopes decreasing the insulin antigen-antibody reactivity measured as a decrease in insulin concentration by RIA. The structural and chemical changes on insulin molecule are related with the lost of biological activity evaluated measuring the increase of U-14C-glucose utilization by human adipose tissue in a radiorespirometry system. The glucose oxidation (14CO2) for the adipose cells was increased in a 35 % ( 301 ± 119 to 407 ± 182 cpm/mg dry weight. p < 0.05) in presence of 0.1 IU and 69 % (301 ± 119 to 510 ± 266 cpm/ dry weight. p < 0.05) for 1.0 IU of insulin. The recombinant human insulin oxidized for 5 minutes only increase the glucose oxidation in 25 %. In conclusion these observations demonstrate that oxidative chemical changes on insulin due its in vitro oxidation decrease and can abolish its biological activity. Our experimental conditions represent the plasma milieu of stress oxidative during Diabetes Mellitus and show that insulin can be damage in this way in vivo.